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【SN商检标准】 芒果细菌性黑斑病菌快速检测方法
- SN/T 4073-2014
- 现行
标准号:
SN/T 4073-2014
标准名称:
芒果细菌性黑斑病菌快速检测方法
标准类别:
商检行业标准(SN)
标准状态:
现行出版语种:
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标准简介:
SN/T 4073-2014.Detection and identification of Xanthomonas cam pestris pv mangiferaeindicae.
1范围
SN/T 4073规定了芒果细菌性黑斑病菌Xanthomonas cam pestris pv.mangiferaeindicae 的检疫鉴定方法。
SN/T 4073适用于进出境芒果的果实、叶片、枝条,组织繁殖材料中可能携带芒果细菌性黑斑病菌的检疫鉴定。
2芒果细菌性黑斑病菌基本信息
学名: Xanthomonas ca m pestris pv.mangi feraeindicae
分类地位:变形细菌门( Proteobacteria) ,Y变形细菌纲(Gammaproteobacteria),黄单胞菌目(Xan-thomonodales) ,黄单胞菌科(Xanthomonodaceae),黄单胞菌属( Xanthomonas)、黑腐黄单胞菌( Xan-thomonas cam pestris)、黑腐黄单胞菌芒果致病变种( Xanthomonas cam pestris pv.mangiferaeindicae)
传播途径:远距离传播主要靠带菌苗木、接穗和果实的调运。
其他信息参见附录A。
3方法原理
根据芒果细菌性黑斑病菌的致病基因hrpB特有碱基序列设计引物进行PCR扩增,并结合半选择性培养基上的培养性状,对该菌进行检疫鉴定。
4仪器设备和主要试剂
4.1 仪器设备
PCR仪、高压灭菌锅、制冰机、高速冷冻离心机、离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡震荡器、电泳仪、凝胶成像系统、天平(感量:0.00g)、高温干燥箱、震荡培养箱、生物安全柜、可调移液枪。
4.2主要 试剂
半选择性培养基NCTM3和NA培养基试剂见附录B,PCR检测试剂见附录C。
部分标准内容:
芒果细菌性黑斑病菌快速检测方法Detection and identification ofXanthomonas campestris pv.mangiferaeindicae2014-11-19发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2015-05-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4073—2014
本标准起草单位:中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国厦门出境检验检疫局、福建农林大学。
本标准主要起草人:王念武、黄伙水、陈劲松、沈建国、王宏毅、翁瑞泉、黄振、胡方平。I
1范围
芒果细菌性黑斑病菌快速检测方法SN/T4073-—2014
本标准规定了芒果细菌性黑斑病菌Xanthomonascampestrispv.mangiferaeindicae的检疫鉴定方法。
本标准适用于进出境芒果的果实、叶片、枝条,组织繁殖材料中可能携带芒果细菌性黑斑病菌的检疫鉴定。
芒果细菌性黑斑病菌基本信息
学名:Xanthomonascampestrispv.mangiferaeindicae分类地位:变形细菌门(Proteobacteria),-变形细菌纲(Gammaproteobacteria),黄单胞菌目(Xanthomonodales),黄单胞菌科(Xanthomonodaceae),黄单胞菌属(Xanthomonas)、黑腐黄单胞菌(Xanthomonascampestris)、黑腐黄单胞菌芒果致病变种(Xanthomonascampestrispv.mangiferaeindicae)传播途径:远距离传播主要靠带菌苗木、接穗和果实的调运。其他信息参见附录A。
3方法原理
根据芒果细菌性黑斑病菌的致病基因hrpB特有碱基序列设计引物进行PCR扩增,并结合半选择性培养基上的培养性状,对该菌进行检疫鉴定。4仪器设备和主要试剂
4.1仪器设备
PCR仪、高压灭菌锅、制冰机、高速冷冻离心机、离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡震荡器、电泳仪、凝胶成像系统、天平(感量:0.001g)、高温干燥箱、震荡培养箱、生物安全柜、可调移液枪。4.2
2主要试剂
半选择性培养基NCTM3和NA培养基试剂见附录B,PCR检测试剂见附录C。5检测鉴定方法
5.1症状检查
仔细观察芒果的果实,叶片和枝条,症状描述参见附录A。5.2
检疫样品的采集及制备
取有疑似症状的芒果果实、叶片、枝条等进行实验室检测鉴定。1
SN/T4073—2014
5.3特异性引物的PCR初筛
提取可疑样品DNA,采用特异性引物Xcm1/Xcm2进行PCR检测。设阳性对照、阴性对照和空白对照,进行PCR扩增,扩增产物进行电泳分析。具体操作和判定见附录C。5.4细菌分离培养
半选择性培养基NCTM3分离,取疑似症状的样品(参见附录A),用清水冲洗干净,晾干后用灭菌的解部刀在病健交界处取一小块病变组织,悬浮于少量无菌水中,用无菌玻棒挤压,然后用接菌环蘸取菌悬液,在NCTM3培养基(配制方法见附录B)、平血上划线分离,28℃下恒温培养5d。挑取疑似单菌落(圆形,乳白色,黏液状,中央隆起,边缘清晰,大小3.0mm~4mm),划线纯化四次后备用。5.5分离菌株特异性引物PCR扩增确认采用特异性引物Xcm1/Xcm2对分离疑似菌株进行PCR检测。设阳性对照、阴性对照和空白对照,进行PCR扩增,扩增产物进行电泳分析。具体操作和判定见附录C6结果判定
6.1在5.3特异性引物的PCR初筛中,若出现阴性结果,则判定为样品未携带芒果细菌性黑斑病菌,若出现阳性结果,继续5.4细菌分离试验阳性、阴性结果的判定见附录C。6.2在5.4细菌分离的基础上,若未出现疑似菌落,则判定样品未携带芒果细菌性黑斑病菌,若出现疑似菌落,则需5.5特异性引物PCR扩增继续判定。6.3在5.5分离菌株特异性引物PCR扩增确认中,若出现阳性结果,则判定为样品带有芒果细菌性黑斑病菌:若出现阴性结果,判定为样品未携带芒果细菌性黑斑病菌。阳性、阴性结果的判定见附录C。7样品保存
7.1样品保存与处理
样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出的芒果细菌性过斑病菌的样品应保存于一20℃冰箱中,以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌杀死病菌后方可做丢弃处理。7.2菌株保存与处理
从检测样品中分离并鉴定为芒果细菌性过斑病菌的菌株,应妥善保存。将菌株接种于NA培养基斜面上,28℃培养48h,然后4℃冰箱保存,或液体培养至对数生长期,加入20%灭菌甘油并混匀,一80℃长期保存或用安管冷冻干燥长期保存。对不需要长期保存的菌株应及时高压灭菌处理。7.3结果记录与资料保存
完整的实验记录包括:样品的来源、种类、时间,实验的时间、地点、方法和结果等,并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片。2
A.1分类地位
附录A
(资料性附录)
芒果细菌性黑斑病菌相关资料
SN/T4073—2014
芒果细菌性黑斑病菌Xanthomonascampestrispv.mangiferaeindicae(Pateletal.)Robbsetal.,变形菌门(Proteobacteria)、-变形菌纲(Gammaproteobacteria)黄单胞菌目(Xanthomonadales)、黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、黑腐黄单胞杆菌(Xanthomonascampestris)、黑腐黄单胞杆菌芒果致病变种(Xanthomonascampestrispv.mangiferaeindicae)。黑腐黄单胞杆菌(X.campestris)有很多不同的致病变种,根据不同的寄主大约有70多种致病变种,如感染十字花科的X.campestrispv.Campestris,感染葡萄的X.cambestrispv.Vitiscarnosae等。A.2地理分布
亚洲:印度,巴基斯坦,马来西亚,日本。我国分布在广东、广西、云南、福建和台湾。非洲:南非,苏丹,埃及,马拉维共和国,刚果,莫桑比克,索马里,摩洛哥大洋洲:澳大利亚。
北美洲:多米尼加共和国。
南美洲:巴西,巴拉圭,法属圭亚那。A,3寄主范围
ca、腰果Anacardiumoccidentale、巴西胡椒Schinus自然条件下侵染芒果Mangiferaincaterebenthifolius、加椰芒果Spondiascythered、槟榔青Spondiasmonbin等漆树科Anacardiaceae植物。和紫葳Bignonia chamberlayni等。人工接种可侵染野芒果SpodiasmangiferaA.4细菌学性状
该菌为短杆状,有1~5根极生鞭毛,革兰氏染色反应阴性。不产生芽孢,无荚膜,多数单排列,鞭毛单根极生。NA平板培养72h,菌落圆形,乳白色,稍隆起,表面光滑,有光泽,边缘完整,大小1.0mm~1.5mm。菌体接种于NA液体培养基置于36℃下不能生长,培养液澄清。在22℃下培养,菌体能生长,培养液稍混浊,在27℃~32℃下培养,生长良好,培养液混浊不透明。A.5生物学特性
病菌潜伏在病叶、病枝条、病果等病组织中越冬,是主要的初侵染源。次年春季在温湿度适宜的条件下,病部溢出菌脓,借风雨、流水或昆虫传播,从伤口和水孔等自然孔侵人,初侵染发病后病部又溢出菌脓,经传播不断进行再侵染。此病全年均可发生。高温、及暴风雨为促进病害主要因子。3
SN/T4073—2014
A.6传播途径
在芒果园内,病菌可以通过容器、工具、土壤、飞溅的雨水传播扩散,并且扩散速度较快。远距离传播主要靠带菌苗木、接穗和果实的调运A.7危害症状
嫩叶感病后,最初出现油渍状小黑点,后扩大成不规则黑褐色斑,常受叶脉限制,呈多角形,发病严重时,几个小斑汇合成不规则大斑,周围有黄晕(见图A.1),叶中脉变黑,局部开裂,老病斑最后转为灰白色;嫩茎感病后,病部明显退色并纵向开裂,渗出胶液变成黑斑;果柄受害,组织坏死引起落果。幼果受害出现暗绿色斑块,周围有油渍状晕圈,后期果肉变为黑褐色,潮湿时病部溢出菌脓(见图A.2),严重的引起大量落叶和落果。该病和芒果炭疽病症状有些相似,芒果炭疽病在叶部症状表现为点状分布,一般不会出现不规则的大斑块(见图A.1),在果实上炭疽病有典型的“泪痕”斑,而细菌性黑斑病则有细菌粘液浸出(见图A.2)。
A.8经济影响此内容来自标准下载网
芒果是重要的热带水果,在热带和亚热带100多个国家和地区广泛种植。全世界每年总产量约为2600~3000万吨,仅次于葡萄、柑桔、香蕉和苹果,位居第五位。亚洲是芒果的重要产地,约占世界总产量的70%,在热带和亚热带水果出口中占有重要地位。芒果细菌性黑斑病是芒果上重要的细菌病害,严重影响芒果生产。该病造成的产量损失一般为15%30%,严重的可达50%。左:芒果炭疽病,右:芒果细菌性黑斑病(引自G.E.Stovold)
图A.1叶片受害状
(引自G.E.Stovold)
2芒果果实受害状
附录B
(规范性附录)
SN/T4073—2014
芒果细菌性黑斑病菌选择性培养基NCTM3和NA培养基配制方法YPGA培养基(pH7.2)
酵母膏
蛋白陈
葡萄糖
蒸馏水
1000mL
按以上配方配好后,调节pH值至7.2,120℃高压灭菌20min。B.2
NCTM3培养基
新霉素
头孢苄胺
甲氧苄啶
匹美西林
丙环唑
将以上药品加人到1000mL的YPGA培养基中。NA培养基(pH7.2)
酵母膏
牛肉浸膏
蛋白陈
葡萄糖
蒸馏水
1000mL
按以上配方配好后,调节pH值至7.2120℃高压灭菌20min。注:该配方中不加琼脂则为NA液体培养基。5
SN/T4073—2014
附录C
(规范性附录)
芒果细菌性黑斑病菌的特异性引物PCR检测方法PCR反应模板的制备
无菌操作下,挑取待测菌的单菌落于NA液体培养基中,28℃、220r/min振荡培养36h,取1mL菌悬液,12000r/min离心
5min,弃上清液,提取DNA(可按CTAB方法提取,也可按市场商品化DNA提取试剂盒提取),提取的DNA保存在一20℃备用。也可告制成菌悬液作为模板,方法是,在离心后的沉淀中加灭菌双蒸水配成1×10°CFU/mL的菌悬液,作为PCR模板备用。模板首先DNA,备选菌悬液。
PCR检测
特异性引物
Xcm1:5'-AGGCCCTGGAAGGTGCCCTGGA-3Xcm2:5'-AGTTCGACCACCTTGCCACA-3C.2.2PCR反应体系
见表c.1。
表C.1PCR反应体系
试剂名称
10×Tag酶缓冲液
正向引物
反向引物
TaqDNA聚合酶
DNA模板
补ddH,0至
C.2.3PCR的反应程序
终浓度
1.5mmol/L
0.2mamol/L
0.5μmol/L
0.5μmol/L
加样量
PCR的反应条件:95℃/5min;95℃/30s,64℃/30s,72℃/40s,35个循环;72℃/10min产物片段长度约为340bp。
PCR扩增产物的检测
产物在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳,再经凝胶成像仪拍照、分析,记录实验结果。6
结果判定
SN/T4073—2014
特异性引物Xcm1/Xcm2,预计扩增片段约为340bp,当阳性对照出现目标条带,而阴性对照及空白对照均未出现目标条带时,实验结果有效实验结果有效时,若PCR扩增产物经凝胶电泳检测结果出现340bp目标条带,则判定为阳性:若未出现目标条带,则判定为阴性。
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