【SN商检标准】 黄瓜花叶病毒检疫鉴定方法

SN
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4405—2015
黄瓜花叶病毒检疫鉴定方法
Detection and identification of Cucumber mosaic virus2015-12-04发布
中华人民共和国
sw.c1w015
涂展查真价
国家质量监督检验检疫总局
2016-07-01实施
发布
前
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4405—2015
本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国重庆出人境检验检疫局，本标准主要起草人：郑耘、卢小雨、张伟锋、向才玉、王红英、龙海、潘广、胡运发、李彬、孔德英、I
1范围
黄瓜花叶病毒检疫鉴定方法
SN/T4405—2015
本标准规定了黄瓜花叶病毒的生物学测定、血清学检测、免疫电镜、RT-PCR检疫鉴定方法，本标准适用于进出境植物种子苗木等繁殖材料和植物产品中黄瓜花叶病毒的检疫鉴定。2规范性引用文件
2
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法SN/T2122
进出境植物及植物产品检疫抽样3基本信息
学名：Cucumbermosaicviru
缩写：CMV
viridae）；黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）。分类地位：雀麦花叶病毒科（Bromo其他信息参见附录A。
原理和方法
4
依据CMV鉴别寄主的症状，病毒形态、免疫学特性及分子生物学特性进行检测判定。5
仪器设备、用具及设施
5.1仪器设备
天平（感量，1/10000g）、pH计、酶标仪、透射电子显微镜、PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、恒温水浴锅、高速离心机、超低温冰箱等。5.2用具
微量移液器、研钵、离心管、花盆、消毒土等。5.3设施
植物隔离检疫温室。
6试剂
DAS-ELISA检测试剂（见附录B)、RT-PCR检测试剂（见附录C)、生物学测定试剂（见8.4）。免疫1
SN/T4405—2015
电镜检测试剂按照SN/T1840的规定执行。7样品制备
7.1种子类
抽样按照SN/T2122的规定执行。将种子（重点挑取畸形、不成熟的种子)播于灭菌土中，于25℃左右生长并进行症状观察。待长出3片～4片真叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组（10株为1组）并编号。7.2
2苗木类
抽样SN/T2122规定抽样。
将苗木种植于隔离温室中，于25℃左右生长并进行症状观察。有症状的苗木单独检测。没有症状的分组检测，分组方法同7.1。
检测方法
8
8.1
DAS-ELISA检测
方法见附录B。
2免疫电镜检测
8.2
按照SN/T1840的规定执行。
8.3
RT-PCR检测
方法见附录C。
8.4
生物学测定
8.4.1接种
病叶加1：1(质量：体积)的磷酸盐缓冲液（0.1mol/L，pH7.2)于研钵中充分研碎，在待接种植物叶片表面均匀洒上硅藻土，用手指蘸取研磨好的汁液轻轻涂抹于叶片表面。8.4.2鉴别寄主症状
宽色藜（Chenopodiumamaranticolor）：褪绿或坏死斑，无系统症状。黄瓜（Cucumis.satius）：绿色或黄绿色系统花叶。昆诺藜（Chenopodiumquinoa）：褪绿或坏死斑，无系统症状。番茄（Lycopersiconesculentum）：系统花叶，叶片变窄。克利夫兰烟（Nicotiana clevelandii）：接种叶无症状，或形成褪绿斑或坏死斑；也可能形成绿色或黄绿色系统花叶或环斑。
心叶烟（Nicotianaglutinosa）：接种叶无症状，或形成褪绿斑或坏死斑；也可能形成绿色或黄绿色系统花叶或环斑。
烟草（Nicotiana tabacum）：接种叶无症状，或形成褪绿斑或坏死斑；也可能形成系统花叶或畸形。菜豆（Phaseolusvulgaris）：冬季表现细小的坏死斑，但夏季无症状表现；无系统症状。2
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结果判定
SN/T4405—2015
DAS-ELISA检测为阳性后，RT-PCR，或免疫电镜检测结果为阳性可判定检出黄瓜花叶病毒。如果上述方法还不能判定检测结果，可进行生物学测定，并进行复验。若DAS-ELISA检测为阴性，则判定为未检出该病毒
10
样品和记录保存
10.1
样品保存
经检测确定携带CMV的样品在合适的条件下保存。种子保存在4℃，病株在一20℃或者一70℃冰箱中保存，提取的RNA样品若需长期保存应放置于一70℃冰箱。做好标记和登记工作。10.2
结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、登记时间、实验地点、检测方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。DAS-ELISA检测需有试验的原始数据，RT-PCR检测需有电泳结果，免疫电镜观察需有病毒粒体照片，生物学测定需有鉴别寄主的症状照片。m
SN/T4405—2015
A.1粒体形态
附录A
（资料性附录）
生物学特性
黄瓜花叶病毒粒子为等轴对称的20面体的球状结构，无包膜，直径约29.3nm。A.2基因组
基因组由三条线形正义单链RNA组成，RNA1和RNA2编码病毒的非结构蛋白，与病毒的复制有关，RNA3编码病毒的运动蛋白和外壳蛋白，基因组大小分别为3357nt、3050nt和2218nt，沉降系数98S，A260/280的比值为1.65.RNA占粒体重的18%。A.3寄主范围
些CMV株系可以携带卫星RNA。
CMV寄主范围广泛，可侵染85科365属1000多种双子叶植物和单子叶植物，是禾谷类作物、牧草、木本和草本观赏植物、蔬菜及果树上发生最广，危害最大的病毒A.4病害症状
CMV幼苗期染病，子叶变
黄枯菱
出幼叶上表现最为明显，老熟叶片症状真叶表现出叶色深浅相间的花叶症状。成株期染病，症状在新不明显。表现为在新出叶片上
上出现黄绿相间的花叶症状，叶片成表现为瓜条出现深浅绿色相间的熟后叶小，皱缩，边缘卷曲。
花斑，染病后瓜条生长缓慢甚至停果实上
止，果表畸形。发病严重时，植株矮、茎节间缩短，
使植株為。C
MV侵染黄瓜后，表现深绿与浅绿相间疣状斑块，果面凹凸不平
或畸形
重病株节间短缩，簇生
小叶，不结瓜，最后萎缩枯死；CMV侵染辣椒后产生花叶、蕨叶、环斑或全株矮化等症状A.5
A.6
分布地区
CMV属世界性分布，尤其是在温带地区。传播方式
A.6.1近距离传播
CMV在田间主要通过蚜虫以非持久性传毒方式传播该病毒，机械摩擦、种子、苋丝子传播也能传播该病毒。
A.6.2远距离传播
CMV通过带毒种子、苗木、组培苗等繁殖材料的运输发生远距离传播。4
B.1试剂
包被缓冲液（pH9.6）
B.1.11
将碳酸钠（NazCO.）1.59g、磷
附录B
（规范性附录）
DAS-ELISA检测
水中，用浓盐酸（HCI)调节pH值直至9.6，并储存于4℃
B.1.2磷酸盐缓冲液（PBS，pH74SN/T4405—2015
鼠钠(NaN：）0.2g定容于1000mL蒸馏将氯化钠（(NaCI)8g、磷酸二氢钾（KH,PO.)0.2g、磷酸氢二钠（Na2HPO4)1.15g、氯化钾（KCI)0.2g、叠氮钠（NaNs)0.2g溶解于900mL蒸馏水，用浓HCI调节pH值到7.4，加水定容至1L。B.1.3PBST缓冲液
HPO,)1.15g、氯化钾（KCI)0.2g、将氯化钠（NaCI)8g、磷酸二氢钾（KHPO,)0.2g、磷酸氢二钠Na吐温20（Tween-20）5mL溶解于
B.1.4样品提取缓冲液（pH7.4）1000ml蒸馏水中
将亚硫酸钠（NazSO：)1.3g、
吐温20（Tween-20)20mL溶解
酶标结合物缓冲液
B.1.5
乙烯
将PBST缓冲液800mL、小牛
(NaN)0.2g，加蒸馏水定容至
B.1.6
底物缓冲液
000
基吡略烷酮（MW24~4000.PVP)20g、叠氮钠（NaN:)0.2g、mLPBST，用浓盐酸（HCI)调节pH值至7.4，并储存于4℃。A)2g、PVP(MW24~4000,PVP)20g、叠氮钠清白蛋白（BS
储存子
将二乙醇胺97mL、叠氮钠（NaN
并储存于4℃。
B.2操作步骤
B.2.1包被
溶解于1000ml蒸馏水中，用浓盐酸（HCI)调整pH至9.8，按照检测试剂盒说明操作。或用包被缓冲液稀释CMV抗体（如1：200），向微孔板中每孔加人100uL包被抗体溶液，37℃下孵育2h～4h或4℃下包被过夜B.2.2
捕获抗原
弃去孔中的抗体包被溶液，用PBST洗4次～5次。加人100μL样品提取液到酶标板的孔中，每个样品重复2个。并设置阳性和阴性对照。37℃下孵育2h或4℃下孵育过夜。5免费标准下载网bzxz
SN/T4405—2015
B.2.3加入酶标抗体
按照检测试剂盒说明操作。用酶标抗体缓冲液按比例稀释相应的酶标抗体（如1：200）。弃去孔中的检测样品提取液，用PBST洗4次～5次孔。每孔加入100μL酶标抗体溶液。在室温下孵育2h。B.2.4加底物
加人底物缓冲液将硝基苯磷酸二钠盐（p-NitrophenylPhosphate，pNPP）配制成浓度为1mg/mL的底物溶液。弃去酶标抗体溶液，用PBST洗4次～5次。每孔加人100uL新配制的底物溶液。室温下避光放置30min～60min，待阳性对照孔显色。B.2.5吸光值的测定
用酶标仪在405nm处读取吸光值
B.3结果判定
通过酶标仪上405nm的OD值来判定。对照孔的OD405值（空白对照、阴性对照及阳性对照)应该在质量控制范围内，即：空白对照和阴性对照的OD40s值<0.15，当阴性对照孔的OD405值<0.05时，按0.05计算。阳性对照有的颜色反应；孔的重复性基本一致。在满足了该要求后，结果原则上可判断如下：样品OD405值/阴性对照OD405值>2，判为阳性。样品OD405值/阴性对照OD405值<2，判为阴性。样品OD405值/阴性对照ODa05值在阈值附近，判为可疑样品，需重新做一次，或用其他方法加以验证。
6
C.1试剂
C.1.1
RNA提取试剂
TRIzol试剂、氯仿、异丙醇、70%乙醇。c.1.2
50×TAE
Tris
冰醋酸
Na2EDTA·2H20
242g
52.1mL
37.2g
附录C
（规范性附录）
RT-PCR检测\》
加去离子水定容至1L。用时加水稀释至1×TAE。C.1.3
6×加样缓冲液
溴酚蓝
蔗糖水溶液
C.2
试验步骤
C.2.1
总RNA提取
0.25%
40%（质量分数）
SN/T4405—2015
称取样品0.1g，液氮充分研磨。加人1mLTRIzol，混匀，倒人1.5mL离心管中。加人0.2mL氯仿，剧烈震荡15s，4℃条件下12000g离心10min，小心吸取上层水相至新离心管中。加人等体积异丙醇，混匀，一20℃静止10min，4℃条件下12000g离心15min，弃上层水相。加人1mL75%乙醇，重悬沉淀，4℃条件下8000g离心10min，弃上层乙醇相，干燥沉淀。加人30μLDEPC-HO，置于50℃条件下5min溶解沉淀，存于一70℃条件下备用。或按照供应商推荐的试剂盒抽提RNA。RT-PCR反应
C.2.2
引物
C.2.2.1
CMV的特异性引物及其序列见表C.1,位于RNA2的CP基因上，预计扩增产物大小为540bp。表c.1
引物名称
CMV-F
CMV-R
RT-PCR的引物和序列
引物序列
5'-GTAGACATCTGTGACGCGA-3
5'-GCGCGAAACAAGCTTCTTATC-3
注：检测引物\CMV-F\和“CMV-R\引自Blas etal.,1994。在GenBank上的基因序列登录号
1）该方法采用KouassiN等（2010）的黄瓜花叶病毒RT-PCR检测方法。在KC527756.1上的位置
1042-1060
1554-1574
7

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