【SN商检标准】 猪支原体肺炎检疫技术规范

SN
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4104—2015
猪支原体肺炎检疫技术规范
Quarantine protocolfor Mycoplasma hyopneumoniae2015-02-09发布
中华人民共和国
刮涂屋套真伪
国家质量监督检验检疫总局
2015-09-01实施
发布
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4104—2015
本标准负责起草单位：中华人民共和国重庆出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、重庆动物疫病预防控制中心、西南大学、重庆正大有限公司。本标准主要起草人：聂福平、杨俊、张强、李应国、曾政、王昱、肖进文、程光胜、王豪举、夏明星。I
1范围
猪支原体肺炎检疫技术规范
SN/T4104—2015
本标准规定了猪支原体肺炎的病理学诊断方法、病原分离和鉴定方法、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验、聚合酶链式反应试验。本标准适用于猪支原体肺炎的检疫、诊断、流行病学调查2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.28食品安全国家标准食品微生物学检验GB/T6682
分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求WS233—2002微生物和生物医学实验3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
3.1
ahyopneumoniae
猪支原体肺炎（Mycoplasma
培养基和试剂的质量要求
，猪地方流行性肺炎，是由猪肺炎支原体引起的一种接触性呼吸系统传猪支原体肺炎又称猪气喘病
染病，是造成养猪业经济损失最重要的疾病之一。该病以咳嗽和气喘为主要临床特征，病变部位主要在肺部，可见心叶、中间叶和尖叶有融合性支气管肺炎变化。该病广泛流行于世界各地，欧洲、亚洲、美洲以及大洋洲等主要养猪国家和地区均有发生。4实验室生物安全要求
4.1检测工作中的个人防护参照GB19489。4.2实验室应遵循GB19489和WS233—2002对生物安全2级（BSL-2)实验室的生物安全要求。4.3使用过的实验用品应遵照GB19489对废弃物的处理要求进行无害化处理。临床和病理学诊断
5
5.1临床症状
猪支原体肺炎是一种发病率高死亡率低的慢性呼吸道传染病，主要临床症状为慢性干咳。新发病猪群常呈急性，张口喘气，痉挛性阵咳，体温升高不明显。咳嗽持续几周甚至数月，育肥猪咳嗽最严重。部分患猪呈腹式呼吸，喘息沟明显。患猪食欲减退，消瘦，被毛粗糙，生长停滞。该病病程主要分急性、1
SN/T4104—2015
慢性两种类型。
5.2
病理学特征
主要病变见于肺、肺门淋巴结和纵隔淋巴结。急性死亡患猪肺有不同程度的水肿和气肿。肉眼病变类似于膨胀不全的肺，尤其在疾病的慢性阶段。特征性病变是两肺的心叶、尖叶和隔叶前缘发生对称性的实变，肺门淋巴结肿大，肺中间叶实变，以及肺门淋巴结肿大、增生。病变最初为栗粒大至豆大呈均匀散布，逐渐扩展而融合成支气管肺炎。病变部界限明显，灰白色，无弹性，呈“胰样”“鱼肉样”。切开时，内有大量泡沫。其他器官无明显变化。5.3病理组织学检查
典型病变组织通过常规的病理学检查，支气管和细支气管上皮组织纤毛数量减少，小支气管周围的肺泡扩大，泡腔充满多量炎性渗出物，肺泡间组织有淋巴样细胞增生。急性病例中，扩张的泡腔内充满浆液性渗出物，杂有单核细胞、中性粒细胞、少量淋巴细胞和脱落的肺泡上皮细胞。慢性病例中，其肺泡腔内的炎性渗出物中主要是淋巴细胞浸润。5.4X线检查
X线检查对本病的诊断有重要价值，对可疑患猪进行X线透视，可做出诊断。在X线检查时，猪只以直立背胸位为主，侧位或斜位为辅。病猪在肺野的内侧区以及心膈角区呈现絮状及片状阴影6
病理分离和鉴定
6.1材料准备
6.1.1
6.1.2
6.1.3
A26肉汤：制备方法见附录A。
固体培养基：制备方法见附录A。厌气肉肝汤：制备方法见附录A。6.1.4
血琼脂平板：按GB4789.28的方法配制。6.1.5
6.1.6
Hank's液：配制方法见附录A。
0.25%鸡红细胞液：制备方法见附录A。6.1.73
灭菌干棉拭子。
6.2病料采集
6.2.1
活体病料采集：用棉拭子深擦拭病猪的喉头或鼻腔，采集呼吸道分泌物。6.2.2
死后病料采集：无菌采取病键交界处肺组织。6.3病原分离
将病肺组织剪成小于2mm的碎块，浸入Hank's液中洗涤，除去血液和组织碎块，取3块～5块浸泡在盛有5mLA26肉汤的试管中；棉拭子浸人10mLA26肉汤中清洗，并压出棉花中残液，再经0.45um的滤膜过滤除菌，将滤液分装于试管中。将上述试管置于含5%～10%CO，环境或用胶塞塞紧管口，在37℃下进行培养。1代～3代分离时，须每经3d～5d，以20%的接种量连续进行移植；4代～5代以后，再经5d～7d连续转移以提高分离率。同时应设厌氧肉肝汤、血琼脂平板作为细菌检查的对照。
通过连续传代，当培养物出现有规则的变化时，应涂片镜检；同时将液体培养物作适当稀释后再接2
SN/T4104—2015
种于固体培养基上，在含5%～10%CO，环境中37℃下培养3d～10d。培养时应逐日在低倍镜下观察，若出现圆形、边缘整齐、似露滴状、中央有颗粒、稍隆起的小菌落，判为可疑菌落，需进一步进行鉴定。6.4生化鉴定
6.4.1溶血试验
挑取可疑菌落接种含猪或鸡红细胞的固体培养基上培养2d～3d，如为猪肺炎支原体，则菌落周围无溶血现象。
6.4.2精氨酸试验
挑取可疑菌落接种于含精氨酸及酚红指示剂的液体培养基中，由于猪肺炎支原体不能分解精氨酸产生氨，故如果指示剂不变色，试验为阴性，反之，则猪肺炎支原体为阳性。6.4.3薄膜和斑点形成试验
挑取可疑菌落接种于含马血清的固体培养基上，由于猪肺炎支原体不能分解其中的脂肪酸，故如果在固体培养基上菌落的表面和周围不能形成薄膜和斑点，试验为阴性，反之，则猪肺炎支原体为阳性6.4.4红细胞吸附试验
将0.25%鸡红细胞液滴加于可疑菌落上，静止后弃去红细胞液，用生理盐水冲洗2次3次，用低倍镜检查，如为猪肺炎支原体，可见菌落表面和周围吸附有大量红细胞。6.4.5结果判定
以上试验皆为阳性者判为猪肺炎支原体7间接血凝试验
7.1
材料准备
7.1.196孔（12×8)V型反应板，微量移液器，微量振荡器等。7.1.2
7.1.3www.bzxz.net
猪肺炎支原体纯化灭活抗原，阳性血清，阴性血清致敏红细胞：为猪肺炎支原体纯化灭活抗原致敏的雄性绵羊红细胞。稀释剂：含1%健康兔血清0.01mol/LPBS(pH7.2）。7.1.4
7.2操作方法
7.2.1
血清的处理
取被检血清0.2mL于无菌小试管中，56℃水浴30min灭活，冷却后加人0.3mL2%戊二醛红细胞悬液，摇匀，置37℃水浴30min，离心后吸出血清供检验用。阳性血清、阴性血清的处理同被检血清。
7.2.2
2血凝试验
见表1。
3
SN/T4104—2015
孔号
稀释倍数
稀释剂
被检血清
2%致敏
红细胞
作用时间
及温度
判定举例
7.2.3
1
1：5
25-
25-
25
操作步骤
2
1：10
25
25
25
3
1:20
25-
25
25
+++
表1
4
1:40
25
25
25
猪肺炎支原体间接血凝试验
6
1：80
25-
25
25
1：160
25-
25
25
7
8
9
10
1：6401:12801:2560
1:320
25-
25
25
25-
25
25
25-
25
25
置2h
25-
25
2
11
弃去25
12
对照
25
25
7.2.3.1
用微量移液器先向反应板每孔中加25uL稀释剂，再向第1孔加人25μL已处理好的被检清，充分混匀后，吸取25uL加第2孔…依次做倍比连续稀释至第10孔（血清的稀释倍数为1：5、1:10、1:20、1：40、1：80、1：160、1:320、1:640、1:1280、1:22560），混匀后从第10孔中取出25L弃去。
7.2.3.2向每孔中加人25μL2%致敏红细胞，血清的最终稀释倍数为1：10、1：20、1：40、1：80、1：160、1：320、1：640、1：1280、1：2560、1：5120。同时.应设立阴、阳性血清对照及敏化红细胞空白对照。
7.2.3.3
置微型振荡器上震荡30
结果判定
7.3
7.3.1
试验成立条件
温静置2
h，观察结果
后，室清
敏化红细胞对照无自凝现象，阳性对照血清抗体价>1：2时表明试验成立。
7.3.2
判定标准
判定标准如下：
阴性对照血清抗体价<1：5（一）十十十十：红细胞100%凝集，在孔底凝集浓缩成团，面积较大；a）
b）十十十：红细胞75%凝集，在孔底形成较厚凝集，面积较大，卷边或呈锯齿状；c）+十：红细胞50%凝集，其余不凝集的红细胞在孔底中央集中成较大的圆点；d）十：红细胞25%凝集，不完全沉于孔底，周围有散在少量的凝集；e)
一：红细胞呈点状沉于孔底，周边光滑7.3.3判定
被检血清抗体价≥1：10（十）者，判为阳性；被检血清抗体价<1：5（一）者，判为阴性；介于二者之间者判为可疑。将可疑猪隔离饲养1个月后，再做检验，若仍为可疑反应，按照阳性反应判定。4
8酶联免疫吸附试验
8.1材料准备
SN/T4104—2015
本标准所用水应符合GB/T6682中二级水的规格。下列试剂除特殊规定外，均指分析纯试剂。8.1.1
酶标检测仪。
8.1.2
8.1.3
8.1.4
8.1.5
8.1.6
8.1.7
8.1.8
恒温培养箱。
可调微量移液器（1μ~10μ，50μ~200μ，50μ~1000μ）。洗板机。
猪肺炎支原体抗原：由指定单位提供。猪肺炎支原体阳性对照血清猪肺炎支原体阴性对照血清：由指定单位提供。辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗猪抗体：由指定单位提供。洗液、包被稀释液、样品稀释液、酶标抗体稀释液、底物溶液、终止液配制方法见附录B。8.2采样
被检动物无菌采血5mL，待血液凝固后，2000g离心10min，分离血清，血清一20℃保存。8.3操作方法
包被抗原：将猪支原体肺炎抗原包被液稀释成工作浓度，包被酶标板，每孔100μL，加盖后，置8.3.1
4℃冰箱包被过夜。
8.3.2封闭：次日取出酶标板，弃去液体后，每孔加人洗液300μL洗板，共3次～5次；加人1%BSA封闭液（或稀释液），每孔100μL，置37箱封闭1h。
恒温
，每孔加入洗液300μL洗板，共3次～5次。最后一次倒置拍干。8.3.3洗板：取出酶标板弃去液体后，8.3.4加样：被检血清用稀释液作稀释，每份血清加2孔每孔100μL。同时设立：猪支原体肺1：40
血清（阴性对照）、空白对照。阳性、阴性血清对照同被检血清猪阴性
炎标准阳性血清（阳性对照）、标准个对照加2孔，每孔100μL。
空白对照同样加2孔，每孔加100μL稀-样，用稀释液作1：40稀释，每释液，室温（18℃~25℃）下作用30min8.3.5洗板：按8.3.3操作。
8.3.6加辣根过氧化物酶标记的抗猪抗体：用稀释液将酶标抗体稀释成工作浓度，每孔100μL，室温（18℃~25℃）下作用30min。
8.3.7洗板：按8.3.3操作。
8.3.8
加酶底物溶液：每孔加100μL，室温（18℃~25℃）下作用15min。8.3.9
终止反应：取出反应板，每孔加100μL终止反应液终止反应。测吸光值：用酶标仪在650nm波长下，以空白对照为参照，测定其吸光值（OD）。8.3.10
8.4结果计算
只有在阳性对照平均值减去阴性对照平均值的差值≥0.15、阴性对照平均值<0.15时，检测结8.4.1
果才有效。
8.4.2计算平均吸光度值。被检样品和各对照的两孔吸光度值之和除以2。8.4.3计算S/P值。样本的S/P值按式(1)计算。样品A-NCx
S/P=
PCx-NCx
（1)
5
SN/T4104—2015
式中：
S/P-
NCx-
PCx
8.5
9
样品的平均OD值-阴性对照的平均OD值与阳性对照的平均OD值-阴性的平均OD值的比值；
阴性对照的平均OD值；
阳性对照的平均OD值。
判定标准
判定标准如下：
阳性反应：被检血清相对平均吸光度值（S/P值）大于0.40；阴性反应：被检血清相对平均吸光度值(S/P值)小于0.30；疑似反应：被检血清相对平均吸光度值（S/P值)大于0.30但小于0.40；所有的疑似反应均需重做或采用其他方法进行比较确认。聚合酶链式反应（套式PCR）
9.1
9.1.1
材料准备
PCR扩增仪。
9.1.2
9.1.3
9.1.4
9.1.5
9.1.6
9.1.7
9.1.8
9.1.9
9.1.10
9.1.11
9.1.12
9.2
6
电泳仪。
凝胶成像系统。
高速冷冻离心机。
可调微量移液器（0.1μ2.5μL、0.5μL10μ、10μ~100μ、20μ～200μL）。琼脂糖。
溴化乙锭（EB)。
Taq酶。
2.5mmol/LdNTP
DEPC水。
分子量指示物：100bp~2o00bpDNAmarker。PBS、Tris-乙酸电泳缓冲液、琼脂糖凝胶、6X加样缓冲液、10×PCR缓冲液，见附录C。引物序列
引物序列见表2。
表2引物序列
引物
F1
P1
F2
P2
核苷酸序列（5~3\)
GCCATTCGCTTATATGGTGA
CGCTTTAGTACCGATATGGG
GATGTTATTTTTGAGACTTGC
AGCAATCATCAGTTTTGCTTG
产物大小
706bp
375bp
9.3操作步骤
9.3.1样品
被检菌株、淋巴结、肺等组织样品及鼻拭子。9.3.2样品处理
SN/T4104—2015
9.3.2.1菌株：挑取可疑菌落于0.01mol/LPBS(pH7.2)中，制成菌悬液或液体培养物。9.3.2.2组织样品及鼻拭子：取组织0.5g～1g剪碎，加人1mLPBS缓冲液，匀浆。鼻拭子在1mLPBS缓冲液中反复挤压。分别将挤下的液体和组织匀浆液100g离心5min，弃沉淀。取菌悬液或上清液按照市售的基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA。其他等效的商品化DNA提取试剂盒或方法也可以采用。
9.3.3对照设立
对照设立如下：
阳性对照用猪肺炎支原体标准菌株DNA，或已知猪肺炎支原体阳性组织制备的模板；a)
阴性对照用胸膜肺炎放线杆菌菌株DNA，或已知猪肺炎支原体阴性组织制备的模板；b）
空白对照等用等体积的DEPC水代替模板。c
9.3.4PCR反应体系
总体积25μL，10×PCR反应缓冲液2μL；氯化镁2μL；dNTP1.5μL；每轮相应引物各0.5μL，模板1μL，阳性和阴性对照10ng～20ngDNA；第一轮用1单位TaqDNA聚合酶，第二轮用0.5单位TaqDNA聚合酶；补水至25μL。
9.3.5PCR反应程序
第一轮PCR使用引物F1/P1，96℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃45s，30个循环；72℃5min。取第一轮PCR反应产物1μL，用引物F2/P2进行PCR扩增，95℃3min；94℃30s，56℃30s；72℃45s，35个循环；72℃5min。9.3.6PCR产物琼脂糖凝胶电泳
取产物5μL与1μL6X加样缓冲液混合，加样于含EB的1.5%琼脂糖凝胶中。在1XTAE缓冲液中，3V/cm～4V/cm电泳约30min，当漠溴酚蓝到达底部时停止电泳，用凝胶成像系统分析结果。阳性、阴性、空白对照和DNA标准分子质量对照品同样电泳。9.3.7结果判定
阳性对照会出现706bp和375bp特异的DNA片段；阴性和空白对照均没有该核酸带。对照成立才能进行判定。
待测样品经PCR扩增后，在706bp和375bpDNA位置上有核酸带，判为阳性样品。套式PCR第一轮706bp有带，第二轮在375bp有带；经第一轮PCR反应无扩增的样品再进行第二轮反应。阳性样品PCR产物应通过核酸序列测定，并与标准参考序列比对，进行确诊。无核酸带或带的大小不在706bp和375bpDNA位置上，判为阴性样品。7

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