【SN商检标准】 基因条形码筛查方法第9部分:检疫性腥黑粉菌

SN
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4877.9—2017
基因条形码筛查方法
第9部分：检疫性腥黑粉菌
DNA barcoding screening method-Part 9:Quarantine Tilletia2017-08-29发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-04-01实施
发布
前言
SN/T4877《基因条形码筛查方法》分为10个部分：第1部分：检疫性棒形杆菌；
第2部分：检疫性黄单胞菌；
第3部分：检疫性植原体；
第4部分：检疫性茎点霉；
第5部分：检疫性拟茎点霉；
第6部分：检疫性嗜酸菌；
第7部分：检疫性轮枝菌；
第8部分：检疫性炭疽菌：
第9部分：检疫性腥黑粉菌；
第10部分：检疫性疫霉。
本部分为SN/T4877的第9部分。
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T4877.9—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院本部分主要起草人：程颖慧、章桂明、王颖、高瑞芳、汪莹、潘广、向才玉、冯建军、史亚千、王红英、谢晓露。
1范围
基因条形码筛查方法
第9部分：检疫性腥黑粉菌
SN/T4877.9—2017
SN/T4877的本部分规定了小麦印度腥黑穗病菌Tilletiaindica和小麦矮化腥黑穗病菌Tilletiacontroversa的DNA条形码筛查中本部分适用于小麦印度黑穗病菌和小麦矮化腥黑穗病菌的筛查2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18085植物检疫小素矮化腥黑穗病检疫鉴定方法GB/T28080小麦印度腥黑
穗病菌检疫鉴定方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
3.1
DNA barcode
DNA条形码
生物体内能够代表该物种的
标准
3.2
的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。ITS
internal transcribed spacer内部间隔转录区序列
在真核生物中，核糖体DNA
是由核糖体基因及
依次为：外部转录间隔区、18S基28S基因和基因间隔序列。内转录内部转录间隔
隔区是存
域，ITS1和ITS2作为非编码区，受外界区组成，其基因组序列从5\到3与之相邻的间隔！
1(ITSI
105.8
手18SrDNA
紫的影响较小
基因、内部转录间隔区2（ITS2）、8SrDNA和28SDNA之间的区
与编码区域相比具有进化速度快的特点，在种内的不同菌株之间高度保守，而在真菌种间存在极大的变化，表现出极大的序列多态性，能够提供详尽的系统学分析所需的可遗传性状4.检疫性腥黑粉菌的基本信息
英文名：QuarantineBunt
学名：Tilletia indica
中文名：小麦印度腥黑穗病菌
学名：Tilletia controversa
中文名：小麦矮化腥黑穗病菌
分类学地位：真菌界（Fungi）、担子菌门（Basidiomycota）、黑粉菌纲（Ustomycetes）、黑粉菌目（Usti-laginales）、腥黑粉菌科（Tilletiaceae）、腥黑粉菌属（Tilletia）1
SN/T4877.9—2017
5方法原理
利用ITS片段作为检疫性病菌的条形码基因，通过对检测对象的DNA进行PCR扩增及产物测序后，利用生物条形码数据（BOLD)或中国检疫性有害生物DNA条形码数据库比对，根据序列相似度筛查物种。
仪器设备和试剂
6
6.1仪器设备
超净工作台、摇床、烘箱、高压灭菌锅、一20℃低温冰箱、PCR扩增仪、冷冻离心机、核酸蛋白分析仪、琼脂糖电泳仪、凝胶成像系统、纯水器。6.2试剂
氯仿、异戊醇、异丙醇、醋酸钠、甲酰胺、70%乙醇、无水乙醇、Tris饱和酚、TaqDNA聚合酶、明胶、溴化乙锭、DNA片段标记物、DNA裂解液、PCR缓冲液、电泳缓冲液、上样缓冲液、dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）、全基因组扩增试剂盒。7筛查鉴定方法bZxz.net
7.1DNA制备
DNA制备方法见附录A。
7.2DNA条形码基因片段扩增
利用通用引物进行ITS片段序列扩增，具体步骤见附录B。7.3序列分析
测序结果利用序列拼接软件进行拼接编辑，比对峰图，判断序列方向，去除测序引物序列，去除两段测序质量Q值小于20的序列，然后在生物条形码数据（BOLD)数据库或中国检疫性有害生物DNA条形码数据库中比对分析。
8结果判定
ITS序列长度约为600bp。如果测定的序列与美国国家生物技术信息中心（NCBI)数据库中比对（AF399890.1，序列参见附录C)相似度大于99%时，可初步判定为小麦印度腥黑穗病菌，进一步鉴定按照标准GB/T28080进行；如果测定的序列与条码数据库中（AF398449.1，序列参见附录C)比对相似度大于99%时，可初步判定为小麦矮化腥黑穗病菌，进一步鉴定按照标准GB/T18085进行。9菌种或标本保存
9.1样品保存
分离到的检疫性腥黑粉菌菌种，转人马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）试管斜面培养基上，置于4℃黑暗2
SN/T4877.9—2017
条件下保存至少12个月，以备复验、谈判和仲裁。获取的菌瘦或菌瘦碎片等标本，密封保存，保存至少12个月，以备复验、谈判和仲裁。结果记录与资料保存
9.2
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片，序列需要保存电子文件。SN/T4877.9—2017
A.1单个孢子DNA获取
附录A
（规范性附录）
DNA制备
菌瘦中冬孢子获取方法：用针刺破菌瘦，挑取不带植物组织的少许孢子，将这些孢子轻轻展布于载玻片上，在低倍镜下观察孢子是否分下确认孢子是否已被成功放置。转移到PCR管的管盖中，在低倍镜镜下人工操作）从孢子悬浮液中吸孢子悬浮液中冬孢子获取方
法：用显微操作系统（或在倒置显微取孢子，所用毛细管孔径为100
整个操作过程在检测器上进行监控，也可在显微镜下直接进行观察，确认孢子已被吸人毛细管内并被转移到PCR管的管盖内用破壁针对放置在PCR管盖中的孢子实施破壁：在10×低倍镜下用破壁针头轻轻挤压孢子，促使孢子壁破裂，使孢子中的核酸释放出来，在显微镜下检测孢子壁是否已经被压破。快速将PCR反应混合液加到PCR管盖中，振荡混匀
然后离心，置于冰上，振荡后离心用全基因组扩增试剂盒对单
单个抱子DNA进行扩增，扩增产物作为原始DNA。
A.2孢子培养物DNA提取
A.2.1孢子萌发
挑取冬孢子，置于2%水琼脂培养基上，18℃~20℃，每日连续光照12h条件下培养10d，解剖镜下检查萌发情况。对萌发的孢子用接种针挑取置于PD
A.2.2孢子培养物的核酸制备
20℃~22℃培养20d。
店养基上
称取0.1g培养物，放在无菌的多层滤纸上，吸去水分，置于无菌的研钵中，用液氮冷冻，用研磨棒将它们研成粉末。
立即转移到2mL的离心管中，加人65℃预热的DNA裂解液（SDS)提取液700μL，置于水浴锅中65℃水浴30min，期间不断混匀。加入5μL10mg/mLRNA酶，充分混匀，在37℃放置30min。加人等体积的Tris饱和酚，充分摇勾，在12000r/min下离心15min。取上清液，加人1：1氯仿-异戊醇（24：1），在12000r/min下离心15min。再取上清液，加人1：1氯仿-异戊醇（24：1），在12000r/min下离心15min。加人等体积预冷的异丙醇，轻轻摇晃，置于一20℃冰箱静置30min，在12000r/min下离心15min。弃上清，加人70%乙醇500μL，12000r/min下离心3min，去上清，重复2次。得到DNA沉淀，用冷冻干燥仪进行干燥，加入30μL～50μLTE或无菌去离子水，充分溶解后，测量DNA的纯度和浓度后置于一20℃冰箱中保存。注：该核酸制备也可采用DNA提取试剂盒法。A.3DNA纯度与浓度的测定
用核酸蛋白分析仪测定DNA的纯度与浓度，分别取得260nm和280nm处的吸收值，计算核酸的4
纯度和浓度，计算公式如下：
DNA纯度=OD260/OD280
DNA浓度=50×OD260（μg/mL）
PCR级DNA溶液的ODz60/ODz8o比值为1.7～1.9。SN/T4877.9—2017
5
SN/T4877.9—2017
B.1ITS片段引物序列
ITSI.TCCGTAGGTGAACCTGCGG
ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC
扩增体系及条件
B.2
附录B
（规范性附录）
扩增程序
扩增反应的组成成分为：10×PCR缓冲液5μL，25mmol/L氯化镁5μL，10mmol/LdNTPS0.25μL，10μmol/L前后向引物各2.5μL.5U/μLTaq酶0.25μL，模板DNA5μL，补充去离子水至50μL。将反应体系混匀后置于PCR仪中进行反应反应用双蒸水作空白对照，阳性对照采用含有小麦印度腥黑穗病菌的DNA作为模板，阴性对照以不含有小麦印度黑穗病菌的DNA作为模板，每个样品重复2次。ITS扩增反应程序为：95℃预热5min，进人循环反应；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸60s，共循环35次，循环后72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳
B.3
每个样品取3L的PCR产物与1μL的6×上样缓冲液混合均勾，并加到含有溴化乙锭(0.5ug/mL）的1.2%琼脂糖凝胶的点样孔中，在120V下进行电泳。电泳结束后在凝胶成像系统中观察、拍照，并保存照片。
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附录C
（资料性附录）
参考序列片段
C.1小麦印度腥黑穗病菌ITS片段参考序列AF399890.1Tilletia indica strain S001SN/T4877.9—2017
CGTAACAAGGTTTCTGTAGGTGAACCTGCAGAAGGATCATTAGTGAATTACGGAGCTCTTCTTCGGAAGAGTCTCCTTCTCTTTTATCCCAACACCAAACTACGGAAGGAACGAGGCCTTGCGCTGAGTACCTGTCCGGATGGAACAGAGTTGCTAGTACTTCGGTATTGGCAGCGCTGCTCCAACCCTTTTAAACACTTAAGAATTAAAGAATGTTAAAACTATTGTCTTCGGACATAAACTAATATACAACTTTTGACAACGGATCTCTTGGTTCTCCCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCCCTTGGGTATTCTCAAGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCATAATACTCTCAACTCTCAATCTTTTTGTAAGAGAAGATTGCTTGGAGTTGGTGATGGGCGCTTGCCAGATGTAACAGTCTTGCTCGCCTTAAATTAATCAGTGGATCTCTTCGAGTCCGGTCTGACTATGTGTGATAATTTGATCACATAGAATGTGCTTGTCACAACCGGATTCTGTATAGAGGCTCTGCTTCCAACACGGAATGATTCTTCGGAATCATCGATAGCTTTGTAGCTTGACCTCA2小麦矮化腥黑穗病菌ITS片段参考序列C.2
AF398449.1TilletiacontroversastrainSo22AGTCGTACCAAGGTTTCTGTAGGTGAACCTGCAGAAGGATCATTAGTGAATCTTTATTGCCGTACTTCTCTTCGAGAGGTCGGCTCTAATCCCATCATCTATTATCCAAACACAAGACTACGGAGGGGTGGCTGCGTTGGTGGCCCCCTGCTCCGGATTGGTTCTGGGTCAGATCATTAACACTGGCTGGCTCGGTTCCTACAACCTTTTCAACTCATGAATCATAGAATGTTAAACCCATTGTCTTCGGACATGAAACTAAATACAACTTTTGACAACGGATCTCTTGGTTCTCCCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCCCTTGGGTATTCTCAAGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCATAACATGTTCAGCTCCCAGCCTTTTTGAAAGAGAAGGTTGCTTGGAGTTGGTGATGGACGTTTTTTGCCAGACCTTACCGTCTTGCTCGTCTTAAATCGATCAGTGGAATCATCTTTTGAGTCCGGTCTGACTATGTGTGATAATTTGATCACATAGAATGTGGGCTTGCCCTACAACCGCATCTTGAAGGACTCTGCTTCCAACACGGAATGGTCTTGGACCATCGTTAGCCTTTTAATGCTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATC
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