【SN商检标准】 国境口岸微孔板基因芯片检测方法第6部分:12种食源性致病菌

SN
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4283.6—2015
国境口岸微孔板基因芯片检测方法第6部分：12种食源性致病菌
Test method of microplategene chipat frontier port-Part 6:Twelvefood borne pathogenic bacteria2015-05-26发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
全层变直行
2016-01-01实施
发布
前言
SN/T4283《国境口岸微孔板基因芯片检测方法》为系列标准，分为六个部分：第1部分：通用技术规程；
第2部分：结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因；第3部分：7种呼吸道病毒；
第4部分：肠道病毒及肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型；第5部分：肺炎支原体、肺炎衣原体及嗜肺军团菌；—第6部分：12种食源性致病菌。本部分为SN/T4283的第6部分。
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T4283.6—2015
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国河南出人境检验检疫局、珠海精标仪器有限公司。本部分主要起草人：赵芳、张勤、张树平、顾大勇、刘春晓、赵纯中、何建安、史蕾、徐云庆、李永进。1范围
国境口岸微孔板基因芯片检测方法第6部分：12种食源性致病菌
SN/T4283.6—2015
SN/T4283的本部分规定了国境口岸金黄色葡萄球菌、沙门氏菌属、大肠杆菌O157：H7、志贺氏菌属、单增李斯特氏菌、蜡样芽孢杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、弧菌属、副溶血弧菌、霍乱弧菌、梭菌属及弯曲杆菌属共12种食源性致病菌的微孔板基因芯片检测方法本部分适用于在国境口岸实验室采用微孔板基因芯片技术对上述12种食源性致病菌进行检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.1食品安全国家标准食品微生物学检验总则GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1543
食源性致病菌基因芯片鉴定方法SN/T2752.4一2011卫生检疫人员的自我防护规范第4部分：实验室人员SN/T4283.1国境口岸微孔板基因芯片检测方法第1部分：通用技术规程WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则3术语和定义
SN/T4283.1和SN/T1543界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1
食源性致病菌foodbornepathogenicbacteria食源性疾病中最常见的生物致病因素，感染后可引起细菌性食物中毒和感染性腹泻的一类细菌。本部分主要涉及了12种常见的食源性致病菌，包括金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、沙门氏菌属（Salmonellaspp.）、大肠杆菌O157：H7（EscherichiacoliO157：H7）、志贺氏菌属（Shigellaspp.）、单增李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）、蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）、小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersiniaenterocolitica）、弧菌属（Vibriospp.）、副溶血弧菌（Vibrioparahaemolyticus）、霍乱弧菌（Vibriocholera）、梭菌属（Clostridiumspp.）及弯曲杆菌属（Campylobacterspp.）。3.2
金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus也称金葡菌”，属于葡萄球菌属（Staphylococcus），为革兰氏阳性球菌，显微镜下排列成葡萄串状，无芽孢、鞭毛，大多数无荚膜。其广泛存在于自然界中，由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒，大约占整个细菌性食物中毒的三分之一。1
SN/T4283.6—2015
3.3
沙门氏菌属Salmonellaspp
具有共同特征的一大属革兰氏阴性肠道杆菌，菌体大小约（0.7um1.5μm）×（2.0μm~5.0μm），周生鞭毛，兼性厌氧。
3.4
大肠杆菌O157：H7EscherichiacoliO157：H7一种肠道出血性大肠杆菌，食物中毒的主要原因之一。属于肠杆菌科埃希氏菌属，革兰氏阴性，无芽孢，有鞭毛。可产生大量的Vero毒素（VT），也称作大肠埃希菌志贺样毒素（Shigatoxin），按免疫原性的不同可分为StxI，StxⅡ，是其主要致病因子。3.5
志贺氏菌属Shigellaspp.
类革兰氏阴性直杆菌，菌体大小约为（0.5μm～0.7μm）×（2.0μm~3.0μm），无芽孢，无荚膜，无鞭毛，有的菌株有菌毛。是人和灵长类的肠道致病菌，引起细菌性疾。3.6
Listeria monocytogenes
单增李斯特氏菌
革兰氏阳性短杆菌，大小约为0.5μm×（1.0μm～2.0μm），直或稍弯，两端钝圆，常呈V字型排列，偶有球状、双球状，兼性厌氧、无芽孢。广泛存在于自然界中，能引起严重食物中毒，主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。
3.7
蜡样芽孢杆菌Bacilluscereus
又称仙人掌杆菌，革兰氏阳性、β溶血性的杆状细菌。菌体细胞杆状，末端方，成短或长链，大小约为（1.0μm~1.2μm）×（3.0μm~5.0μm），产芽孢。广泛存在于自然与食物中，在夏秋季极易引发食物中毒，主要症状为腹痛、呕吐腹泻。3.8
小肠结肠炎耶尔森氏菌Yersiniaenterocolitica属肠杆菌科，为革兰阴性、卵圆形粗短杆菌，可产生耐热肠毒素。冬着发病较多见，主要是通过污染的饮水和食品经消化道传播，临床表现以急性胃肠炎、小肠结肠炎和败血症等类型为主。3.9
弧菌属Vibriospp
革兰氏阴性菌，形状短小，约0.5um×（1.0um～5.0um），因弯曲如弧而得名。普遍存在于海洋、河口与水生生物体，人常因进食未煮熟的污染本菌的海产品或盐渍食物（蔬菜、肉类、蛋等）而受感染。3.10
副溶血弧菌Vibrioparahaemolyticus又称嗜盐菌，属于弧菌属。该菌嗜盐畏酸，在无盐培养基上，不能生长，3%～6%食盐水繁殖迅速。对人和动物均有较强的毒力，临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状3.11
霍乱弧菌Vibriocholera
属于弧菌属，为需氧菌，营养要求不高，在pH8.8～pH9.0的碱性蛋白陈水或平板中生长良好。共分为139个血清群，其中O1群和O0139群可引起霍乱，主要表现为剧烈的呕吐、腹泻、失水，死亡率甚高，属于国际检疫传染病，为我国的甲类法定传染病。3.12
梭菌属Clostridiumpp
革兰氏阳性大杆菌，又称梭状芽孢杆菌属或厌氧芽孢杆菌属。菌体呈梭状，常排列成对或短链，圆2
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的或渐尖的末端。广泛分布在环境中，许多种可产生外毒素，如肉毒梭菌分泌的肉毒素，其毒力强，误食后严重时可导致呼吸困难和心力衰竭而死亡。3.13
弯曲杆菌属Campylobacterspp.
主要为螺旋形、S形或弧形以及杆状细菌。革兰氏阴性，菌体大小（0.2μm～0.5μm）×（1.5μm～5μm），较长的可有4个～5个弯曲。共有17个菌种和6个亚种，在人类疾病中最常发生的为空肠弯曲菌（空肠亚种）和大肠弯曲菌，常见临床症状包括腹泻（经常伴有便血）、腹痛、发热、头痛、恶心和/或呕吐。
4缩略语
SN/T4283.1界定的以及下列缩略语适用于本文件。Stx：大肠埃希菌志贺样毒素（shigatoxin）5生物安全防护要求
5.1实验室应遵循GB19489和WS233对应的生物安全要求5.2实验人员的防护遵循SN/T2752.4—2011的要求。6主要设备和试剂
6.1主要设备：基因芯片点样仪、芯片杂交仪、芯片清洗显色仪、生物芯片全自动扫描判读仪、PCR仪、生物安全柜、离心机、移液器、恒温水浴锅等。6.2主要试剂：食源性致病菌微孔板基因芯片检测试剂盒或自行设置的食源性致病菌微孔板基因芯片检测试剂（相关引物及探针序列参见附录A）7检测流程
样品核酸的提取
7.1
可以直接从样品中提取基因组DNA，提取方法参照SN/T4283.1，也可依照GB4789.1以及SN/T1543方法对样品进行增菌培养后，提取基因组DNA。7.2PCR扩增反应
7.2.1可使用试剂盒附带的试剂按说明书要求配置PCR反应体系，或自行配置25μLPCR反应体系：10XPCR缓冲液2.5uL，dNTPs（各5umol/L）2μL，MgCl（25mmol/L）2μL，所有上下游引物（含PCR阳性对照）（各5μmol/L)混合液2μL，TaqDNA聚合酶0.25μL，模板核酸5μL（含阳性对照核酸1μL，主要为细菌基因组DNA),ddHzO11.25μL；振荡混勾，并轻微离心7.2.2将上述PCR反应管放人PCR仪，设定PCR反应程序：首先95变性5min：然后95℃C变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存备用；若需长期使用请置于一20℃保存。
7.3微孔板基因芯片杂交反应
7.3.1开启芯片杂交仪，并设置芯片杂交仪预加热至45℃。3
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7.3.2按试验要求准备所需的微孔板基因芯片：并准确、清晰标记。将杂交反应液平衡至室温，轻轻摇动混合均勾后，分别取100L加人微孔板各检测孔中；在桌面轻轻平行晃动微孔板，使各孔中的杂交反应液均匀覆盖于芯片检测表面并且无气泡产生，如有气泡可以用洁净的细针或加样枪头去除。7.3.3取样品PCR产物10μL于PCR仪中95℃加热5min，待PCR仪降温至4℃后取出并立即置于冰上备用。
7.3.4取上述已变性处理的PCR产物10μL加入芯片的对应检测孔中，贴上杂交反应盘胶膜，置于芯片杂交仪中45℃，振荡反应1h。7.4微孔板基因芯片显色反应
7.4.1杂交反应结束后，取出微孔板芯片将微孔内的液体用力用出倒空，每孔加入洗涤液200μL，在桌面轻轻平行晃动微孔板20s（以反应孔内液体不溢出为限），然后）用力甩干反应孔中液体，重复上述动作2遍，最后一次在液体倒掉后将芯片置于擦手纸上轻拍数次，以去除残留液体。7.4.2于各反应孔中加人100m显色检测液室温静置反应20min后，用力甩干反应孔中液体。然后加人200μL洗涤液，静置1min，甩干孔中液体，重复上述动作2遍，最后一次在液体倒掉后将芯片置于擦手纸上轻拍数次，以去除残留液体7.4.3于各反应孔中加人100μL显色液，室温避光反应8min后，用力甩干孔中液体。ddH,0冲洗芯片内部，于擦手纸上轻拍数次，以去除残留之液体，置于50℃烘箱或室温干燥。注：配置芯片清洗显色仪的可使用仪器自带程序，按照操作说明书实施7.4的步骤和流程。7.5微孔板基因芯片结果检
测
将显色反应后的芯片放人生物芯片全自动扫描判读仪内，扫描获得杂交结果图。运行设定的图像分析软件，选择食源性微生物芯片结果分析程序，依据芯片探针设置模式（参见附录B)，对扫描获得的杂交结果进行自动化的数据分析判定，，获得检测结果。
结果报告
8
检测结果可报告为“微孔板基因芯片检测方法：×××，X×阳性；X××，×××（如有，列出全部阴性检测目标）为阴性”。9
阳性结果的处置
检测结果为阳性的样品应做进一步确诊。9.1
9.2确诊为阳性结果后应按规定和程序向相应部门报告。4
（如有，应列出全部阳性检测目标）为附录A
（资料性附录）
食源性致病菌微孔板基因芯片检测相关的引物及探针食源性致病菌微孔板基因芯片检测相关的引物及探针如表A.1所示表A.1
目标名称
金黄色葡萄球菌
沙门氏菌属
大肠杆菌0157：H7
志贺氏菌属
单增李斯特氏菌
蜡样芽孢杆菌
小肠结肠炎耶尔森氏菌
弧菌属
副溶血弧菌
食源性致病菌微孔板基因芯片检测相关的引物及探针引物及探针序列
F:AATTO
GATTGTTTTATAAGGT
R:TAATGGGGATATCATTTT
P:GTACGTTAG
F:TGGATTAATGCCAAAG
GAAA
R:CTAAAACCAGO
P:ACAATAC
AAAGGCGA
TCCGGCAGG
GCACGCCATAAT
TTTCGTACAACACTTGATG
FGGGAT
R:ACAAT
TTCAGTATTAATGCCACG
P(StxI):TTCAG)
TCGTACA
P(StxI):TAATGGAGTTCAGT
PGGTAA
FTCAACCAGTA
R:ATTA
TCCTG
TGAAO
TAAC
TGAAT
P.CAGGC
TGATACCAG下载标准就来标准下载网
CTTTGTG
F:AAACTTGG
R:GAG
GATTT
AGCTA
ACCAAA
TAAG
TCAGO
FTTAG
ATGAAAATCAGCTGG
P:TTAA
AA
F.TATGGTCGTAAAAATAG
CATT
R:CACTAATTGCTGGATCTTTCGA
AGAGC
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P:TCGTGAAGGTTTAACAGCAATTGTATCAATCAAGCAF:ATAAAAAGGCACTAAAAGCCTATGCGCR：TCCCAGGAACCATTCAGCGGAA
P:TTGGCTGCTGATGTACTGGG
F:AACTCAAATGAATTGAC
R:GGCCCGGGAACGTATTC
P:GCATACAGAGGGCGGCC
F：AACCAAACCTATACCTATGTTCG
R:GGCAATGTATTCTGTCCACACAAA
P:TAAAAACATGTTCTACACCAACA
SN/T4283.6—2015
目标名称
霍乱弧菌
梭菌属
弯曲杆菌属
PCR阳性对照（16SrRNA）
杂交阳性对照
阴性对照
表A.1（续）
引物及探针序列
F：TGGAGAGAAAAACACTCACTGTGG
R:AATGGCTGGTTTGGGTTCCA
P:GTGCGGAATCGGCACTGGCGGCAG
F:AACTCAAATGAATTGAC
R:GGCCCGGGAACGTATTC
P:CTTGCATAGCCTAGAGATA
F:AACTCAAATGAATTGAC
R;GGCCCGGGAACGTATTC
P:CACGTATTTAGTTGCTAA
F:AAAACTCAAATGAATTGACGG
R:GTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTP:GTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATG
P：ATGAAGCAYGTCAGGGCRTGGATACCTCGP:TCCTCCAATTTGTCCGGTTATCGCT
注1：F表示上游引物，R表示下游引物，P表示探针。注2：引物5'端生物素修饰。
注3：探针5端20个poly(T)的修饰。注4：序列中R代表A/G.Y代表C/T。注5：杂交阳性探针的配对杂交片段为5'端生物素修饰的CGAGGTATCCAYGCCCTGACRTGCTTCAT。6
附录B
（资料性附录）
食源性致病菌微孔板基因芯片检测探针设置模式食源性致病菌微孔板基因芯片检测探针设置模式如图B.1所示。D
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注：A1,A5，E1，E5：杂交阳性对照探针点；A2，A4,C1,C4，C5，E2.E4：阴性对照探针点；A3：梭菌属B1：金黄色葡萄球菌B2：沙门氏菌属；B3：大肠杆菌O157：H7StxI；B4：大肠杆菌O157：H7StxⅡ；B5：志贺氏菌属；C2：弧菌属；C3：PCR阳性对照探针点；D1：单增李斯特氏菌D2：蜡样芽孢杆菌；D3：小肠结肠炎耶尔森氏菌；D4：副溶血弧菌；D5：霍乱弧菌：E3：弯曲杆菌属。图B.1
食源性致病菌微孔板基因芯片检测探针设置模式图
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