【SN商检标准】 临床检验标本中毒品成分的定性及定量分析方法.第1部分:氯胺酮

SN
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4401.1—2015
临床检验标本中毒品成分的
定性及定量分析方法
第1部分：氯胺酮
Methods of qualitative and quantitative analysis for drug in clinical sample-Part 1:Ketamine
2015-12-04发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2016-07-01实施
发布
前言
SN/T4401《临床检验标本中毒品成分的定性及定量分析方法》分为4部分：第1部分：氯胺酮；
第2部分：甲基苯丙胺类毒品；
第3部分：吗啡类毒品；
第4部分：大麻类毒品。
本部分为SN/T4401的第1部分。
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国福建出人境检验检疫局本部分主要起草人：高博、曹洁、张建明、蔡怡珊、黄恩炯、肖武。SN/T4401.1-2015
1
1范围
临床检验标本中毒品成分的
定性及定量分析方法
第1部分：氯胺酮
SN/T4401.1—2015
尿液和血清中氯胺酮的三种测定方法，即气相色谱-质谱/质谱法SN/T4401的本部分规定了人体
（GC-MS/MS）、液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）和气相色谱法［包括配氢火焰离子化检测器（GC-FID），配氮磷检测器（GC-NPD）本部分适用于人体尿液和血清中氯胺酮的定量测定：气相色谱-质谱/质谱法、液相色谱-质谱/质谱法同时适用于人体尿液和血清中氯胺酮的定性确证2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3气相色谱-质谱/质谱法（GC-MS/MS）3.1原理
试样在碱性条件下，用乙酸乙酯提取生物检材中的氯胺酮，采用多反应监测质谱扫描模式（MRM），用化合物的保留时间和质谱特行征碎片离子丰度比定性，外标法定量。3.2试剂与材料
3.2.1实验用水为GB/T6682规定的二级水。3.2.2
3.2.3
3.2.4
3.2.5
3.2.6
氢氧化钠：分析纯。
甲醇：色谱纯。
乙酸乙酯：分析纯。
氯胺酮标准品：CAS6740-88-1，纯度>99.0%。氯胺酮标准储备液：准确称取10mg（精确到0.1mg）盐酸氯胺酮标准品于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成浓度为1mg/mL标准样品储备液。于一18℃以下冰箱中避光保存一年。试验中根据需要稀释使用。3.2.7氨气：纯度≥99.999%。
3.2.8
氮气：纯度≥99.999%。
3.3
仪器及器材
3.3.1
3.3.2
气相色谱-质谱/质谱（GC-MS/MS)仪：配有电子轰击电离离子源（EI）。氮气吹干仪。
1
SN/T4401.1—2015
3.3.3
3.3.4
3.3.5
离心机：转速不低于4000r/min。分析天平：感量0.1mg。
超声波水浴。
3.3.6
涡旋混合器。
3.3.7
实验室常用玻璃器材。
3.4样品前处理
取尿液或血清1mL置于10mL具塞离心管中，用4mol/L氢氧化钠调pH13,用2mL乙酸乙酯分别萃取两次，以10000r/min离心3min，有机层合并转移至另一试管中，于40℃下氮气吹干，残留物用200μL甲醇溶解，取1μL进GC-MS/MS分析。3.5气相色谱-质谱/质谱测定
3.5.1
仪器参考条件
包括：
a）
色谱柱：5%苯基甲基聚硅氧烷石英毛细管柱，30m×0.25mm（内径）×0.25um，或相当者。b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)
i)
j)
k)
1)
流速：1.0mL/min。
程序柱温：120℃保持1min，以20℃/min的速率升温至250℃，保持1min。进样口温度：250℃。
接口温度：280℃。
进样方式：分流。分流比：10：1。进样量：1μL。
电离方式：电子轰击电离（EI)。电离能量：70eV。
离子源温度：230℃。
四极杆温度：150℃。
碰撞气：氮气。
扫描方式：多反应监测（MRM），定量离子m/z180>116.1（最优碰撞能量25V），定性离子m）
m/z：180>151（最优碰撞能量10V）)，m/：180>145.1（最优碰撞能量10V）。3.5.2标准曲线的绘制
取空白样品按照3.4处理。用所得的样品溶液将氯胺酮标准储备液（3.2.6)逐级稀释得到的浓度为0.5μg/mL、1μg/mL、2ug/mL、5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL的标准工作液，浓度由低到高进样检测。以标准工作溶液浓度为横坐标，定量离子质量色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。标准溶液的GC-MS/MS多反应监测质量色谱图参见附录A中的图A.1。3.5.3定量测定
待测样液中氯胺酮的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析，3.5.4定性判定
按照上述条件测定试样和标准工作溶液，如果试样中的质量色谱峰保留时间与标准工作溶液一致（变化范围在土2.5%之内），样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表1的规定，则可判断样品中存在氯胺酮。2
相对离子丰度比
允许的相对误差
3.5.5
结果计算
表1定性离子相对丰度的最大允许偏差>50%
±20%
>20%至50%
±25%
以外标-校准曲线法或按式(1)计算被测样品中氯胺酮浓度。C
式中：
C
A,
V2
Cs
A2
Vi-
A,V
A,V.
Xcs
>10%至20%
±30%
SN/T4401.1—2015
≤10%
±50%
（1）
检材中氯胺酮的浓度，单位为微克每毫升或者微克每克（μg/mL或μg/g）；进样甲醇溶液中氯胺酮的峰面积；进样甲醇溶液体积；
加标样品中氯胺酮的浓度，单位为微克每毫升或者微克每克（μg/mL或ug/g）；加标样品中氯胺酮的峰面积：
检材的体积。
3.6
空自试验
除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。3.7方法定量限
本方法的定量限为2ng/mL。
3.8
回收率
选择氯胺酮浓度低中高三个浓度水平分别为：0.5ug/mL、2μg/mL和20μg/mL，每个浓度水平采用五个平行样品进行标准氯胺酮样品添加回收以及精密度试验，结果表明其回收率均在80%～120%之间，相对标准偏差均<10%。
3.9允许差
样品应按以上步骤同时平行测定两份，在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的15%时，定量数据可靠，按两份检材平均值出定量结论。相对相差>15%，定量数据不可靠，需重新进行测定。
4液相色谱-质谱/质谱法（LC/MS/MS）4.1原理
试样在碱性条件下用乙酸乙酯提取生物检材中的氯胺酮，用液相色谱-质谱/质谱法测定和确证，外标法定量。
4.2试剂
4.2.1试验用水为GB/T6682规定的二级水。3
SN/T4401.1—2015
4.2.2
4.2.3
4.2.4
4.2.5
4.3
4.3.1
4.3.2
4.4
乙睛：色谱纯。
甲酸：色谱纯。
乙酸胺：色谱纯。
其他同3.2。
仪器及器材
液相色谱-质谱/质谱（LC-MS/MS)仪：配有电喷雾离子源（ESI)。其他同3.3。
样品处理
取尿液或血清1mL置于10mL具塞离心管中，用4mol/L氢氧化钠调pH13，用2mL乙酸乙酯分别萃取两次，以10000r/min离心3min，有机层合并转移至另一试管中，于40℃下氮气吹干，残留物用200μL甲醇-水（1：1）进行溶解，溶液再稀释100倍，过045μm有机系滤膜，取5μL进LC-MS/MS分析。
4.5
液相色谱-质谱/质谱测定
4.5.1
LC参考条件
包括：
a)
b)
c)
d)bZxz.net
e)
4.5.2
色谱柱：C18填料柱，150mm×4.6mm（内径）×5μm或相当者。流动相：流动相A为纯净水加2%甲酸和5mmol/L乙酸铵，流动相B为乙腈，洗针液为1：1的甲醇水。液相梯度洗脱如表
液相梯度洗脱方法
2
表
时间
min
0.50
2
3
4
5~8
进样量：5μL。
柱温：40℃。
流速：1mL/min。
MS/MS参考条件
包括：
a
b)
c)
电离方式：电喷雾电离，正离子。离子喷雾电压：5.5kV。
雾化气：氮气，60psi。
注：1psi=6.895kPa。
B相乙睛比例
%
10
20
90
90
10
干燥气：氮气，60psi，温度650℃。d)
e）
f）
碰撞气：氮气。
分辨率：Q1（单位)Q3（单位）。SN/T4401.1—2015
扫描模式：多反应监测（MRM），母离子m/238.2，定量子离子m/z125.1，定性子离子m/zg）
179.2,m/z220.1。
h）碰撞能量：m/238.2>125.1为40eV，m/z238.2>179.2为22eV，m/238.2>220.1为18eV。
其他参数：去簇电压(DP)为26V，人口电压为（EP)10V，碰撞池出口电压（CXP)为3V，色谱i）
峰保留时间为3.89min。
4.5.3标准曲线的绘制
取空白样品按照4.4处理。用所得的样品溶液将氯胺酮标准溶液（3.2.6）逐级稀释得到的浓度为5ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL.50ng/ml.100ng/ml.200ng/ml的标准工作液，浓度由低到高进样检测，以定量子离子面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。基质加标氯胺酮样品LC-MS/MS多反应监测质量色谱图参见图A.2。
4.5.4定量测定
待测样液中氯胺酮的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。4.5.5定性判定
以标准品的保留时间以及多反应监测离子（m/z23定性，其他定性判定原则同3.5.4。4.5.6结果计算
同3.5.5。
4.6
空白试验
除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行4.7
方法定量限
本方法的定量限为0.3ng/mL，
回收率
4.8
212
、m/z238.2>179.2、m/z238.2>220.1选择氯胺酮浓度低中高三个浓度水平分别为：5ng/mL、50ng/mL和200ng/mL，每个浓度水平采用五个平行样品进行标准氯胺酮样品添加回收以及精密度试验，结果表明其回收率均在80%～120%之间，相对标准偏差<10%。
允许差
4.9
样品应按以上步骤同时平行测定两份，在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的15%时，定量数据可靠，按两份检材平均值出定量结论。相对相差>15%，定量数据不可靠，需重新进行测定。
5
SN/T4401.1—2015
5气相色谱法（GC-FID和GC-NPD）5
5.1原理
试样中的氯胺酮经乙酸乙酯萃取处理后，用气相色谱配有氢火焰离子化检测器（FID)或气相色谱配有氮磷检测器（NPD)进行检测，与平行操作的氯胺酮标准样品进行比对，以保留时间RT值或相对保留时间RRT值定性，用峰面积外标法定量。5.2试剂
同3.2。
5.3仪器及器材
5.3.1
气相色谱仪：配有氢火焰离子化检测器（FID)和氮磷检测器（NPD）5.3.2
2其他同3.3。
5.4样品处理
取尿液或血清1mL置于10mL具塞离心管中，用4mol/L氢氧化钠调pH13,用2mL乙酸乙酯分别萃取两次，以10000r/min离心3min，有机层合并转移至另一试管中，于40℃下氮气吹干，残留物用200μL甲醇溶解，取1μL进GC分析。5.5气相色谱测定
5.5.1
仪器参考条件
5.5.1.1
GC/FID参考条件
包括：
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)
5.5.1.2
色谱柱：5%苯基甲基聚硅氧烷石英毛细管柱，30m×0.25mm（内径）×0.25μm，或相当者。流速：1.5mL/min。
程序升温：120℃保持2min，以45℃/min的速率升温至280℃，保持5min。进样口温度：280℃。
检测器温度：300℃。
进样方式：分流，分流比：50：1。进样量：1μL。
载气：氮气，纯度≥99.999%；氢气流量：30mL/min；空气流量：400mL/min；尾吹气流量：25mL/min。
GC/NPD参考条件
包括：
a)
b)
c)
d)
e)
f)
6
色谱柱：5%苯基甲基聚硅氧烷石英毛细管柱，30m×0.25mm（内径）×0.25μm，或相当者。流速：3mL/min。
程序升温：100℃保持2min，以20℃/min的速率升温至250℃。进样口温度：280℃。
检测器温度：340℃。
进样方式：分流，分流比：30：1。进样量：1μL。
g)
SN/T4401.1—2015
载气：氮气，纯度≥99.999%；氢气流量：3mL/min；空气流量：60mL/min；尾吹气流量：10mL/min。h）
5.5.2标准曲线的绘制
取空白样品按照5.4处理。用所得的样品溶液将氯胺酮标准储备液（3.2.6)逐级稀释得到的浓度为1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL的标准工作液，浓度由低到高进样检测。以目标物的峰面积对浓度作图，得到校准曲线回归方程。基质匹配加标氯胺酮的样品GC-FID色谱图参见图A.3，基质匹配加标氯胺酮的样品GC-NPD色谱图参见图A.4。5.5.3定量测定
待测样液中氯胺酮的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。5.5.4结果计算
同3.5.5。
5.6
5.7
空白试验
除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。方法定量限
本方法中，GC-FID法的定量限为3μg/mL，GC-NPD法的定量限为1μg/mL。5.8
回收率
选择氯胺酮浓度低中高三个浓度水平分别为：5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL，每个浓度水平采用五个平行样品进行氯胺酮标准样品添加回收以及精密度试验，结果表明其回收率均在80%～120%之间，精密度均<10%。
5.9
充许差
样品应按以上步骤同时平行测定两份，在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的10%时，定量数据可靠，按两份检材平均值给出定量结论。相对相差>10%，定量数据不可靠，需重新进行测定。
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