【SN商检标准】 蜜蜂囊状幼虫病检疫技术规范

SN
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3990—2014
蜜蜂囊状幼虫病检疫技术规范
Quarantineprotocolforsacbrood diseaseof bees2014-11-19发布免费标准下载网bzxz
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2015-05-01实施
发布
前
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。言
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3990—2014
本标准起草单位：中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国吉林出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：郑腾、张体银、李宋钰、张志灯、宋战的、王武军、白泉阳、王伟利。1范围
蜜蜂囊状幼虫病检疫技术规范
本标准规定了蜜蜂囊状幼虫病的临床诊断方法和实验室诊断方法。本标准适用于蜜蜂囊状幼虫病的临床诊断与检疫鉴定。2规范性引用文件
SN/T3990—2014
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3临床诊断
3.1箱外观察法
当蜜蜂外出活动采集时，可看到密虫，则需进一步对蜂群进行检查。3.2蜂群检查法
在蜂箱前也可观察到零散的死亡幼打开蜂箱观察封盖子脾，检查是否存在死亡幼虫比健康幼虫多的现象。由于发病初期病虫不断被工蜂清除，因此脾面上会出现卵、小幼虫、大幼虫、封盖
清理不及，可以
图A.1)。但病害严重时，病虫多，工蜂量不规则孔洞，露出患病幼虫上翘的头部呈“头”状
排列不
规则的现象，即所谓“花子脾”现象（参见虫巢房被工蜂咬开，巢房盖有大在脾面上
见到病！
有大量的透明液体聚积。用镊子小心夹住其头部
体苍白色、无味
幼虫头部将其提出，可见虫体末端明显的囊状袋，虫乳白色变褐色，当虫体水分蒸发后喝色的鳞片
会干燥成黑褐
无黏性（参见图A.2）。死虫逐渐由头尾部略上翘，形如“龙船状”。死虫体不具黏性、无臭味、易清除。通过检查幼虫和封盖子脾，可以依据以上特征性病变做出初步诊断。如需进一步确诊，可进行实验室诊断。
3.3鉴别诊断
在临床诊断时应注意将本病与美洲幼虫腐臭病相区别。美洲幼虫腐臭病又称为“烂子病”，是由幼虫芽孢杆菌引起的一种幼虫的细菌性传染病，和囊状幼虫病有相似之处，它们都是引起封盖后的幼虫大量死亡，但这两种疾病各有特点，应注意区别（见表1）。1
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病种
囊状幼虫病
美洲幼虫腐臭病
实验室诊断
4
表1蜜蜂囊状幼虫病与美洲幼虫腐臭病临床诊断时的区别要点病原
病毒
细菌
设备、材料和试剂
4.1
4.1.1
设备
4.1.1.1
4.1.1.2
4.1.1.3
4.1.1.4
4.1.1.5
4.1.1.6
4.1.1.7
4.1.2
梯度PCR扩增仪。
台式冷冻高速离心机。
发病时间
封盖子发病
封盖子发病
无臭味
腐败、鱼
腥臭味
死亡虫体特征
无黏性
黏性强，用镊子
可拉成细丝
枯千后呈褐
色龙舟状
黑色鳞片样
微量移液器（100μL~1000μL，20μL200μL，2μL~20μ，0.5μL~10μ）。电泳系统。
凝胶成像仪系统。
电子天平（感量0.01g）。
防护用具（包括蜂帽、防蛰手套、养蜂工作服和喷烟器）。材料和试剂
4.1.2.1
F1
普通RT-PCR检测用引物（对）序列为：5'-ACCAACCGATTCCTCAGTAG-3\
R15-CCTTGGAACTCTGCTGTGTA-3\扩增片段约469bp。
4.1.2.2
4.1.2.3
4.1.2.4
4.1.2.5
4.1.2.6
4.1.2.7
4.1.2.8
4.1.2.9
4.1.2.10
4.1.2.11
4.1.2.12
4.1.2.13
4.2
4.2.1
焦炭酸二乙酯处理水（DEPC水）。无水乙醇。
脱氧核苷酸三磷酸（dNTPs）。
琼脂糖（电泳纯）。
溴化乙锭（10mg/mL）。
分子量标准(100bp~1000bp）。
电泳缓冲液。
加样缓冲液。
DNA纯化回收试剂盒。
RNA抽提、反转录和PCR扩增可以采用等效的提取方法或试剂盒。蜜蜂囊状幼虫病病毒标准株，由指定单位提供。试验用水应符合GB/T6682中三级水的规格要求。采样、送样和处理
幼虫样品的采集和处理
枯干后易与
巢房分离
枯干后不易
与巢房分离
如果蜂群有典型的临床症状，可以无菌割取一小块带有病虫或死虫的巢脾，也可无菌挑取单个病虫2
SN/T3990—2014
或死虫若干只装人无菌的小试管内，供检测用。如果蜂群没有典型的临床症状，可以随机无菌挑取幼虫若干只分别装人无菌的小试管内，供检测用。4.2.2成蜂样品的采集和处理
如果蜂群有典型的临床症状，可以用灭菌后的镊子挑取蜂群内巢脾上或蜂箱底部带有典型病状的蜜蜂，以及在蜂箱前爬行的垂死蜜蜂和死亡蜜蜂20～30只，分别装人无菌的小试管内，供检测用。4.3操作步骤
4.3.1RNA提取
4.3.1.1RNA提取按QIAGEN\公司的RNA抽提试剂盒（RneasyMiniKit)进行。选取不超过30mg待鉴定虫体或蜂体，置于DEPC处理过的研钵中，加人液氮进行研磨，将研磨得到的粉末，快速转移至无RNase并经过液氮冷却的1.5mL离心管中。4.3.1.2加人600μL缓冲液RLT，颠倒混匀，高速涡旋振荡30s，10000g离心3min，取上清，转移到另一个1.5mL离心管。
4.3.1.3加人600μL70%的乙醇，立即吹打混匀。4.3.1.4将吸附柱置于收集管中，将4.3.1.3中混匀的混合物吸入吸附柱中，8000g离心15s，倒掉废液，将吸附柱重新放回收集管中。4.3.1.5加人700μL缓冲液RW1到吸附柱中，8000g离心15s，倒掉废液，将吸附柱重新放回收集管中。
6加人500μL缓冲液RPE到吸附柱中，8000g离心15s，倒掉废液，将吸附柱重新放回收集4.3.1.6
管中。
4.3.1.7
加人500μL缓冲液RPE到吸附柱中，8000g离心2min，取出吸附柱。将吸附柱中置于新的收集管中，10000g离心1min，以去除残留的缓冲液RPE。4.3.1.8
将吸附柱中置于1.5mL离心管中，加人30μL～50μLDEPC水，8000g离心1min，离心所得溶4.3.1.9
液中即含有RNA。含有RNA的溶液应在2h内进行RT-PCR扩增，否则应在一7O℃的条件下保存。4.3.1.10RNA提取可选用等效的商品化试剂盒或等效的提取方法。4.3.2RT-PCR
反转录合成cDNA
4.3.2.1
4.3.2.1.1变性和退火
反转录合成cDNA可选用等效的商品化试剂盒，下面以Promega2公司的反转录试剂盒（ReverseTranscriptionSystem）进行cDNA合成。在200μLPCR管中加人10μLRNA模板，70℃孵育10min，短暂离心后置于冰上。
4.3.2.1.2cDNA合成
在另一个200μLPCR管中加人氯化镁2.5μL、反转录10×缓冲液2.5μL、dNTP2.5μL、重组的Rnasina核糖核酸酶抑制剂0.5μL、AMV反转录酶20U、随机引物1μL、RNA模板2μL,补充DEPC1）使用QIAGEN公司的RNA提取试剂盒进行描述只是为了叙述方便，并不代表推荐QIAGEN的产品，标准的使用人可以使用其他公司的同类产品。使用Promega公司的反转录试剂盒进行描述只是为了叙述方便，并不代表推荐Promega的产品，标准的使用2）
人可以使用其他公司的同类产品。3
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水至25μL。将反应体系在室温下温育10min，然后在42℃下孵育60min。反应结束后，95℃5min灭活反转录酶，冰浴5min。
4.3.2.2PCR扩增DNA
扩增DNA按TIANGEN3公司的DNA扩增试剂盒（2XTaqPCRMasterMix）进行。在200μLPCR管中依次加人以下试剂：2×PCRMasterMix12.5uL，F1和R1各1μL，模板2μL，加DEPC水到总体积25μL，混匀，短暂离心5。将PCR管置于PCR扩增仪。先94℃5min，再开始35次循环（核酸变性94℃30s；引物退火55℃30s；延伸72℃45s），然后再72℃延伸10min，最后4℃保温。PCR扩增DNA可选用等效的商品化试剂盒。4.3.2.3琼脂糖凝胶电泳
用TBE电泳缓冲液（见B.1)配制2%的琼脂糖凝胶平板，其中含有1μg/mLEB（见B.2）。将平板放人水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将6μLPCR产物和2uL上样缓冲液（见B.3）混勾后加人样品孔中进行电泳。在电泳时设立DNA标准分子量Marker作对照。5V/cm电泳约0.5h，当漠酚蓝到达底部时停止。
4.3.2.4测序
使用凝胶成像分析系统观察核酸条带并判断结果，经核酸扩增电泳后如出现一条大小约469bp的DNA片段，应对其切胶回收后进行测序，参考序列参见附录C。4.3.2.5
结果判定
经核酸扩增电泳后阳性对照会出现一条469bp的DNA片段，而阴性对照和空白对照没有该核酸条带。待检样品经核酸扩增电泳后.在相应469bpDNA位置上有条带并经测序验证者为阳性。无条为阴性
带或条带的大小不是469bp的
5综合判定
5
经过箱外观察法、蜂群检查法和鉴别诊断后，疑似囊状幼虫病的幼虫或成蜂应经RT-PCR确认阳性后，方可判为发生了囊状幼虫病。使用TIANGEN公司的DNA扩增试剂盒进行描述只是为了叙述方便，并不代表推荐TIANGEN的产品，标准3）
的使用人可以使用其他公司的同类产品。4
附录A
（资料性附录）
患蜜蜂囊状幼虫病的子脾和幼虫图A.1患蜜蜂囊状幼虫病的子脾
图A.2患蜜蜂囊状幼虫病的幼虫
SN/T3990—2014
SN/T3990—2014
B.1
TBE电泳缓冲液（5倍浓缩液）
Tris
硼酸
EDTA
加水到
54.0g
27.5g
2.9g
1000mL
用5mol/L的盐酸（HCI)调到pH8.0。EB（核酸染色剂）
B.2
附录B
（规范性附录）
试剂配制
用水配制成10mg/mL的浓缩液。用时每10mL电泳液或琼脂中加1μL。B.3上样缓冲液
每100mL溶液中含有澳酚蓝0.25g和蔗糖40g。6
附录C
（资料性附录）
SN/T3990—2014
密蜂囊状幼虫病病毒基因组核苷酸参考序列（GeneBankAF092924)RT-PCR扩增参考序列如下：
(221)
accaaccgat
cgcgccagaa
acaatcctta
aatggttggg
gatgagagtg
ggaactatag
gctgctaaga
ccctcgaagg
tcctcagtag
tctataaaac
cctctagtaa
tttctggtat
gacgaagaat
tgtggcgaaa
gtatattggt
aatctattca
tggaggaatc
caagttggag
gaagacattt
gtttgttgac
ctggaatgtt
agttattact
acaattttta
gggggacgct
agaagaaatc
gcgcgtaatt
gatacagtgg
aagaacgtcc
agacgcgcag
tcgtacagtt
ggtcctataa
acacagcaga
agtcttctga
atatagttca
gcggagtgga aagattatct
actcttatac
actacaccga
tgtcaattaa
gtaaggtagc
cgatttgttt
aatgtccagt
60
120
180
240
gaccacagaa
300
ttcagaacta
ggacccagag
tgatgaggta
gttccaagg
（689)
360
420
469

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