【SN商检标准】 DNA条形码方法第1部分:检疫性乳白蚁

SN
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4876.1—2017
DNA条形码方法
第1部分：检疫性乳白蚁
DNA barcode-Part 1:QuarantineCoptotermes spp.2017-07-21发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-03-01实施
发布
前言
本部分为SN/T4876《DNA条形码方法》系列标准的第1部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草SN/T4876.1—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国珠海出人境检验检疫局，中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国湖北出人境检验检疫局。本部分主要起草人：张卫东、权永兵、许彩芸、钱路、黄永辉、迟远丽、徐浪、廖力、徐森锋、余道坚安榆林、王振华。
I
1范围
DNA条形码方法
第1部分：检疫性乳自蚁
SN/T4876的本部分规定了我国检疫性乳白蚁的DNA条形码检测方法。SN/T4876.1-2017
本部分适用于我国进境植物检疫性乳白蚁DNA条形码的测定、结果的比对分析与判定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件SN/T1105大家白蚁检疫鉴定方法3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
DNA条形码
DNA barcodes
一段短的、标准化的基因片段，用于区分不同的物种。该片段在种间存在明显的遗传变异和分化并容易进行PCR扩增。DNA条形码技术主要用于物种识别和新种发现。3.2
凭证标本voucherspecimens
DNA条形码的实物参考凭证，凭证标本信息包括馆藏信息、采集信息，鉴定信息，用于复核。模式标本是用于分类学研究的凭证标本3.3
COⅡ基因
线粒体基因组的蛋白质编码基因，全称为细胞色素c氧化酶亚基Ⅱl（cytochromecoxidasesubuniⅡ），由于该基因进化速率较快，常用于分析亲缘关系密切的种、亚种及地理种群之间的系统关系4乳白蚁基本信息
中文名称：乳白蚁
学名：Coptotermesspp.
分类地位：等翅目Isoptera，鼻白蚁科Rhinotermitidae，乳白蚁属CoptotermesWasman。乳白蚁属是世界性的重要害虫种之一，目前全世界有效定名的乳白蚁近70种。主要危害房屋建筑中的木结构，也危害埋地塑料和绿化树木。乳白蚁近距离传播靠成虫飞行扩散，远距离传播主要借助于原木、板材、木方及木质包装等铺垫材料等扩散1
SN/T4876.1—2017
5方法原理
根据乳白蚁的COⅡ序列特征，应用DNA条形码技术对乳白蚁进行鉴定。仪器设备、用具及试剂
6
6.1仪器设备与用具
常规PCR仪、微量分光光度仪、电泳仪、凝胶成像系统、酸度计、测序仪、高速冷冻离心机、生物安全柜、烘箱、高压灭菌锅、解镜、天平（感量17摇床、水浴锅、制冰机、纯水仪、旋涡震荡器、一70℃冰箱、冰箱、微量移液器（0.5μL，2μL.10μL.20μL，100L，200μL1000μL）、PCR反应管（o.2mL
0.5mL)。
6.2试剂
除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂提取液（含1%SDS、50mmol/LTris-HCl.25mmol/LNaCl.25mmol/LEDTA).3mmol/LKAc（pH7.2）、Tris饱和酚、蛋白酶K、氰仿、异戊醇、异丙醇、75%乙醇、无水乙醇、RNaseA、10×PCR缓冲DL2000Marker、琼脂糖、溴化乙液、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）TagDNA聚合酶引物（见表1）、锭（EB）。
表1扩增引物
目标基因
co
TY-F
TY-R
7DNA条形码鉴定
7.1
样品的处理
5*-GTGCATT
GGAT
物序列
AAGC
5-CTTGCTTTCAGTCATCTGATG-3
扩增片段大小/bp
763
样品的处理见SN/T1105。尽可能选择新鲜标本，标本保存于无水乙醇中，每份标本单管保存，并做好唯一性标识。
7.2
核酸的制备
取白蚁于双蒸水中漂洗，吸水纸吸干，解剖镜下剔除腹部，取胸部肌肉和足置于1.5mLEppendorf管中，加入4oμL提取液（含1%SDS，50mmol/LTris·Cl25mmol/LNaCl.25mmol/LEDTA），放置于一70℃冰箱中，4min后取出，用牙签捣碎，勾浆，加入等体积的3mmol/LKAc（pH7.2），冰上放置1h，酚/氯仿提取基因组DNA，溶解在H2O中，用微量分光光度仪测定DNA浓度和纯度后，将样品于一20℃保存备用。
核酸制备也可采用昆虫DNA提取试剂盒法。7.3DNA纯度与浓度的测定
用微量分光光度仪测定DNA的纯度与浓度，分别取得260nm和280nm处的吸收值，计算核酸的2
纯度和浓度，计算公式如下：
DNA纯度=OD260/OD280
DNA浓度=50×OD260μg/mL
PCR级DNA溶液的OD260/OD280比值应为1.7~1.9。7.4PCR检测
7.4.1PCR扩增
SN/T4876.1—2017
每个样品设置两个平行反应，同时设置空白核酸提取对照和空白扩增对照。PCR反应体系总体积为50μL，包含5μL10×PCR缓冲液（含Mg）、4μL的dNTP混合物（各10mmol/mL）、上下游引物各2μL（10μmol/mL）、rTaqDNA聚合酶1μL（5U/μL），20ng~100ngDNA模板，最后加ddHO补充至总体积为50uL，体系配好后进行PCR扩增。PCR反应条件为：94℃预变性5min；35个循环为94℃变性1min.58℃退火45s、72℃延伸1min；最后72℃延伸5min，结束后产物于4℃冰箱保存。7.4.2琼脂凝胶电泳
取5μLPCR产物，在1.5%琼脂糖凝胶（5V/cm）电压进行电泳，EB染色，凝胶成像系统观察、拍照。
7.4.3PCR产物回收和克隆测序
取剩余PCR扩增产物45μL，使用DNA产物纯化试剂盒纯化回收产物，进行克隆测序。7.4.4DNA序列数据的处理
使用DNA测序仪对目的条带进行双向测序，PCR扩增引物作为测序引物，测序原理同Sanger测序法。为确保测序结果的可靠性，需对测序质量进行评估，去除测序结果两端的低质量序列，质量评估以碱基的Q值为依据。应用软件进行序列拼接，去除引物区，获得包含685bp大小的完整COⅡ基因序列，序列方向应与PCR扩增正向引物方向8结果判断
8.1中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统判定登录中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统（http：//qbol.org.cn），点击“物种识别”导航条，进人物种识别页面。在鉴定框内输人FASTA格式（或纯文本格式)序列后，点击“提交鉴定”，系统进行BLAST后，自动生成鉴定结果。当相似度最高的10条序列为相同物种，最大相似度在98%以上，且COⅡ结果相符，可明确判定为该物种（参见附录A）；否则请辅以其他鉴定方法。8.2国际通用数据库判定
登录GenBank数据库BLAST鉴定系统（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），在BLAST结果中查看序列相似性最高的物种，COⅡ基因序列结果与已知乳白蚁种类基因序列相似性最高，相似度最高的10条序列为相同物种，且最大相似度在98%以上，可明确判定检出相应的乳白蚁种类。常见的乳白蚁种类COⅡ基因序列表信息参见附录B。3
SN/T4876.1—2017
9
标本与原始数据保存
9.1标本保存
采集到的标本应乙醇浸渍低温保存，并注明货物来源，寄主，采集时间、地点及采集者，保存期为1年，以备复验，如涉及贸易纠纷则应保存到纠纷解决完毕。保存期满后，按后期用途长久保存或处理。原始数据保存
9.2
样品检测结束后，其原始记录单和检验报告或证书应归档，妥善保管，以备复验、谈判和仲裁。4
附录A
（资料性附录）
中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统操作方法中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统操作方法见图A.1、图A.2。中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统DNA BARCODEAPPRAISALSYSTEM ON CHINESEQUARANTINEPESTS首页
动物整定
COI&ITS
植物有害生物动物疫病
真菌鉴定
输入fasta格式的序列
ATGACAACATGATTAAACATAA
TAAAAAGGA
AACACTAAAAGCA
AGICFGA
DAA
GTATCO
提交鉴定
植物鉴定
(rbcL&matk&ITS]
G
CAATGATCIGAAGATA
微生物鉴定
[165]
医学蝶介
物种识别
LGAAACAAL
O2012-2015中国检检检度科学研究院质权所有图A.1
物种识别页面
中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统DNA BARCODE APPRAISAL SYSTEM ON CHINESE QUARANTINE PESTS百页
序列些离码
CYTC5223-
12
CYTC5229-
12
CYTC5240-
12
CYTC4896-
12
CYTC417-12
CYTC4888-
12
CYTC423-12
门
植物有害生物
纲
Chordata
Chordata
Chordata
Chordata
Chordata
Chordata
Chordata
Mammalia
Mammalia
Mammalia
Mammalia
Mammalia
Mammalia
Mammalia
动物病
目
Artiodactyla
Artiodactyla
Artiodactyla
Artiodactyla
Artiodactyla
Artiodactyla
Artiodactyla
医学媒介
相似样本鉴定结果
科
Bovidae
Bavidae
Bovidae
Bovidae
Bovidae
Bovidae
Bovidae
图A.2
属
Bos
Bos
Bos
Bos
Bos
Bos
Bos
物种识别
种
SN/T4876.1—2017
收票|进入管理系统
凭证标本
关于我们
ETCITATCCTTLTE
TPAOR
LAGAACAT
GACAA
GGACAACCGAATI
GAAAOT
收基|进入营理系统
凭证标本wwW.bzxz.Net
关于我们
相似度
Bos taurus
Bos taurus
Bos taurus
Bos taurus
Bos taurus
Bos taurus
Bos taurus
鉴定结果页面
93.18%
93.18%
93.18%
93.18%
93.18%
93.18%
93.18%
遇传标记
col
coll
coll
col
col
coll
coll
E-Value
3.07868e-08
3.07868e-08
3.07868e-08
3.07868e-08
3.07868e-08
3.07868e-08
3.07868e-08
5
SN/T4876.1—2017
附录B
（资料性附录）
常见乳白蚁种类线粒体细胞色素氧化酶基因（COⅡ）序列常见乳白蚁种类线粒体细胞色素氧化酶基因(COⅡI)序列见表B.1。表B.1
学名
C.acindciformis
C.amanii
C.brunneus
C.curvignathus
C.dreghorni
C.frenchi
C.formosanus
C.gestroi
C.kalshoveni
c.lacteus
C.michaelseni
C.sepangensis
C.sjostedti
C.testaceus
C.travians
C.truncatus
6
常见乳白蚁种类线粒体细胞色素氧化酶基因（COⅡ）序列信息中文名
短不乳白蚁
阿曼乳白蚊
曲颚乳白蚁
大唇乳白蚁
台湾乳白蚁
格斯特乳白蚁
卡肖乳白蚁
澳洲乳白蚁
塞庞乳白蚁
非洲乳白蚁
南美乳白蚁
南亚乳白蚁
GenBank登录号
KJ918272.KJ918281,KJ918276,KJ918273，KJ918270,KJ918269,KJ918267，KJ918282.KJ918275，AB005583，DQ367827.KJ918806,KJ918274,KJ918278,AF262610.KJ918277KJ918340.KJ918250.KJ918338,KJ918337KJ907839，KJ907838,KJ918339，KJ918336,KJ918279.
KJ918280.DQ367826
KJ918335.
923247.JF923246.JF923245
KJ918305
AJ854177AJ854179，FJ384634,AJ854180，AJ854178KJ918313
KJ918342.KJ918320,KJ918302.KJ918322,KJ918343KJ918308.KC
15425.KU925203.KJ918309.KJ918307.KC515433,KC515
5415,AB626147.AB626146.AB626145.AY683218.FJ8705
77，FJ870566，AB109529，AY683212.AY168204-AF107488,KC515424,AY027489,AY536403.AY536404,EF056707
KC515409，
AJ854173
KC51541
1.KC515408.KC515403.AJ854175.AJ854176AJ854174KU925205，GQ994994，AY536402,KC515
414，HQ231233，EF379956，AJ854171，EU805750.EF3
9953.EF379955.EF379954.EF379945.EF379951,EF8
879947.EU805757.EF379944.JX128695.JX128693.FJ384649.AJ854172.AY295078KU925210.KU925209.AJ854168.AJ854167.AJ854166KU925211,KJ918299,KJ918292,AY536410.DQ367840.EU253886AF220600.FJ806883.KJ918258.KJ918257.JX144934,DQ367841,KJ918296
KU925212,KJ918326.KJ918349,KJ918348.KJ918346.KJ918316.DQ367839.DQ367838
AJ854163.KU925214.KU925215
KU925216
KU925218.KU925220.KU925219.DQ442102KU925221.KU925222.AJ854170.AJ854169KJ918303.FJ818986
参考文献
SN/T4876.1—2017
[iJHebertPDN,Cywinska A,Ball SL,et al.Biological identifications through DNA barcodes.ProcRSocLondB.2003,270（1512)：313-321.[2]Margaret C G,Rubinoff D,Grace J K.Phylogenetic analysis of subterranean termites (Coptotermes spp.,Isoptera: Rhinotermitidae) indicates the origins of Hawaiian and North American invasions: potential implications for invasion biologyLJJ.Proceedings of Hawaiian Entomological Society,2008,40：1-9.
[3JScheffrahn RH,Krecek J,BoudanathJK,et al.Establishment of the African termite,Coptotermes sjostedti (Isoptera: Rhinotermitidae),on the island of Guadeloupe,French West IndiesJJ.Systematics,2004,97(5):872-876.[4]LahayeR,van der Bank M,Bogarin D,et al.DNA barcoding the floras of biodiversityhotspots.ProcNatlAcadSciUSA,2008,105(8)：2923-2928.SchindelDE,MillerSE.DNAbarcoding,auseful tool fortaxonomists.Nature,2005,435:17.[5]
[6]
陈士林.中药DNA条形码分子鉴定.北京：人民卫生出版社，2012：1-510.
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